腸球菌の病原性/定着因子としてのバクテリオシンの役割

细菌素作为肠球菌毒力/定植因子的作用

基本信息

批准号：
12770130
负责人：
富田治芳
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

臨床分離腸球菌E.faecalisからフェロモン反応性接合伝達性バクテリオシンプラスミドpYI14(61kb)を分離した。このプラスミドを保有する宿主はこれまで報告されているI〜III型バクテリオシン(溶血毒素型バクテリオシン等)とは異なる活性域を示すバクテリオシンを産生し、新たなタイプ(IV型)と考えられた。シャトルベクターを用いた連関クローン法により制限酵素地図を作成した。pYI14は16個のEcoRI断片A〜Pで構成され、その順はAHMLJKOBDNPGIEFCであった。連関クローンのうちEcoRI断片AH(16kb)を含むクローンのみが腸球菌内でバクテリオシンを発現した。このクローンを含む宿主は自身のバクテリオシンに対して耐性を示すことから、バクテリオシンに対する免疫能決定因子もこの断片内に保持していることが判明した。この発現クローンを用い、バクテリオシン遺伝子の遺伝学的解析を行った。制限酵素を利用した欠失変異株を作製し、トランスポゾンTn5,mini-Tn7による挿入変異株を分離した。これらの変異株の解析から約6kbの領域がバクテリオシン発現に必要であること、またこの領域は少なくとも二つの機能領域に分かれることが明らかとなった。さらに、得られた変異株間でのバクテリオシン活性相補試験により、その前半はバクテリオシン前駆体の発現の領域、後半は前駆体型バクテリオシンの活性化(成熟化)と免疫能の領域であることが明らかとなった。バクテリオシン発現領域を含む約12kbの領域の塩基配列を決定した。発現領域には同一方向に転写される少なくとも5個のORF(ORF3058,5109,5689,6123,6693)が存在した。前半領域には595個のアミノ酸をコードするORF3058が存在し、グラム陽性菌の種々の細胞壁溶解(溶菌)酵素と高い相同性を示し、これがバクテリオシン前駆体構造遺伝子(bacA)であると推測された。この下流に存在する2つのORF(ORF5106,5689)も前駆体発現に関与していることが変異株の解析から推測された。後半領域には726個のアミノ酸をコードするORF6693が存在し、これがバクテリオシン活性化因子(bacB)であると推測され、これは枯草菌染色体に存在する機能不明な遺伝子ybfGと高い相同性を示した。

从临床分离的粪肠球菌中分离出信息素反应性接合细菌素质粒 pYI14 (61 kb)。携带该质粒的宿主产生的细菌素表现出与迄今为止报道的I型至III型细菌素（溶血毒素型细菌素等）不同的活性范围，并被认为是一种新类型（Ta型）。使用穿梭载体通过链接克隆方法创建限制酶图谱。 pYI14由16个EcoRI片段A至P组成，顺序为AHMLJKOBDNPGIEFC。在连锁克隆中，只有含有EcoRI片段AH(16kb)的克隆在肠球菌中表达细菌素。由于含有该克隆的宿主对其自身的细菌素表现出抗性，因此表明该片段还含有决定细菌素免疫性的因素。使用该表达克隆进行细菌素基因的遗传分析。使用限制酶创建缺失突变体，并分离使用转座子 Tn5 和 mini-Tn7 的插入突变体。对这些突变菌株的分析表明，细菌素表达需要约6kb的区域，并且该区域被分成至少两个功能区。另外，通过对所获得的突变株之间的细菌素活性互补试验可知，前半部分是细菌素前体表达的区域，后半部分是前体细菌素活化(成熟)和免疫能力的区域。确定了含有细菌素表达区的约12kb区域的核苷酸序列。表达区至少有5个ORF（ORF3058、5109、5689、6123和6693）以相同方向转录。 ORF3058编码595个氨基酸，存在于前半区，与革兰氏阳性菌的多种细胞壁溶解酶具有高度同源性，推测为细菌素前体结构基因(bacA)。对突变菌株的分析表明，位于其下游的两个 ORF（ORF5106 和 ORF5689）也参与前体表达。后半区存在编码726个氨基酸的ORF6693，推测其是细菌素激活剂(bacB)，与枯草芽孢杆菌染色体Ta中存在的功能未知的基因ybfG具有高度同源性。