バンコマイシン耐性腸球菌VREの新たな高頻度接合伝達性プラスミドの研究

一种新的耐万古霉素肠球菌VRE超接合传播质粒的研究

基本信息

批准号：
19041013
负责人：
富田治芳
金额：
$ 5.31万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

日本の臨床分離VRE株(E, faecium)加ら新たに分離したpMG1型ハンコマイシン耐性高頻度接合伝達性プラスミドpHTβは、バンコマイシン耐性を他の腸球菌へ高頻度で伝達させると同時に宿主菌に凝集性を与える。pHTβはpMG1と遺伝子配列上高い相同性を示し、構造的に非常に近縁の伝達性プラスミドであることが示された。pHTβのトランスポゾンTn917-lacを用いた挿入変異プラスミドの作製分離とその解析から、プラスミド上の接合伝達に関与する3つの領域(Tra I, Tra II, Tra III)を同定した。さらにpHTβにコードされる凝集領域の解析を行った。凝集領域のクローン化、及びその遺伝学的解析から、凝集に必要な領域を決定した。凝集にはTra I内上流域に存在するORF9~ORF13の5個のORFが関与していた。この領域の転写を調べたところ、ORF9上流の高いプロモーター活性領域から始まる長い転写産物が検出され、これらのORFはオペロン構造を形成していた。またTra II領域内のORF56のトランスポゾン挿入変異あるいは欠失変異は伝達性と凝集性を失っており、同時にORF10、ORF13の転写活性も著しく低下していた。それらの形質はクローン化したORF56により相補されたことから、ORF56はプラスミドの伝達性、凝集性を転写活性レベルで正に調節する遺伝子であることが示され、traBとした。traB上流には恒常的な活性を示すプロモーターが存在し、traB下流に位置するtraAとオペロン構造をとっていた。pMG1にコードされ、traBと同等の遺伝子である710RF1のプラスミドを作成し解析した。予想に反し、pMG1のtraB同等変異プラスミドは伝達性を完全には失わず、野生型と比べその伝達頻度は十分の一程度の低下であった。この結果はtraBがTra Iの凝集遺伝子領域および接合伝達遺伝子領域の転写活性を別め因子を介し、おそらく間接的にORF9上流のプロモーター領域に働くことにより調節していることを示唆している。

pMG1型汉古霉素抗性超接合转移质粒pHTβ是从日本临床分离的VRE菌株（屎肠球菌）中新分离出来的，经常将万古霉素抗性转移到其他肠球菌中，同时聚集到宿主细菌中产生性。 pHTβ与pMG1在基因序列上表现出高度同源性，表明它是结构上非常密切相关的可传播质粒。使用 pHTβ 转座子 Tn917-lac 生产和分离插入突变质粒及其分析，鉴定出参与质粒接合转移的三个区域（Tra I、Tra II、Tra III）。此外，我们分析了 pHTβ 编码的聚集区域。通过克隆凝集区域及其遗传分析来确定凝集所需的区域。位于 Tra I 上游区域的 5 个 ORF（ORF9 至 ORF13）参与聚集。当我们研究该区域的转录时，我们检测到从ORF9上游的高活性启动子区域开始的长转录本，这些ORF形成了操纵子结构。此外，Tra II区域内ORF56的转座子插入或缺失突变丧失了传递性和聚集性，同时ORF10和ORF13的转录活性也显着降低。这些性状得到了克隆的ORF56的补充，表明ORF56是在转录活性水平上正向调控质粒可转移性和聚集性的基因，被命名为traB。 traB上游有一个组成型活性启动子，与位于traB下游的traA形成操纵子结构。构建并分析了由pMG1编码且与traB等同的基因710RF1的质粒。与预期相反，pMG1 traB等效突变质粒并没有完全丧失其传播能力，其传播能力比野生型低了约十分之一。这一结果表明traB通过不同的因素调节Tra I聚集基因区和接合转移基因区的转录活性，或许是通过作用于ORF9上游的启动子区来间接调节。