プロテインCインヒビター遺伝子の組織特異的発現制御機構の研究

Protein C抑制基因组织特异性表达调控机制研究

• 批准号: 09780544
• 负责人: 林 辰弥
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780544/
• 关键词: プロテインCインヒビター; シスエレメント; Sp1結合部位; AP2結合部位; A-activator結合部位; Interferon-γ反応性エレメント

プロテインCインヒビター(PCI)は、血液凝固制御因子の活性化プロテインC(APC)に特異的な血漿阻害因子で、α1アンチトリプシンなどと相同な構造を有する血漿セリンプロテアーゼインヒビター(SERPIN)ファミリー蛋白質の1つである。また、PCIは精漿中に血漿中の約40倍も高濃度に存在し、男性不妊症患者精漿中では著しく低下していること、また精子の先体にも存在し、卵との受精に関わっていることが示唆されいる。これまでに、本奨励研究の補助の基、PCI遺伝子の肝(HepG2)細胞における発現調節領域としては、ヒトPCI遺伝子の5'上流域(約1.6kb)中のSp1結合部位(-302〜-294残基)がプロモーターとして、2個のAP2結合部位のうち、Spl結合部位より上流側のAP2結合部位(-350〜-343残基)がエンハンサーとして、A-activator結合部位(-422〜-414残基)およびlnterferon-γ反応性エレメント(-164〜-157残基)がサイレンサーとして機能し、Sp1結合部位より下流側のAP2結合部位は機能していないことをルシフェラーゼ(Luc)をレポーター遺伝子として明らかにした。また、HepG2細胞由来の核蛋白質を用いたゲル移動度シフト解析より、Sp1結合部位および上流側のAP2結合部位には、HepG2由来のSplおよびAP2がそれぞれ結合すること、およびA-activator結合部位およびInterferon γ反応性エレメントにはこれまで報告されていない未知の核蛋白質が結合することを明らかにした。さらに、HepG2細胞におけるPClの発現が、強力な発ガンプロモーターのPhorbol miristate acetate(PMA)により転写レベルで抑制されること、また、PMA反応性エレメントは、約1.6kbのPCI遺伝子の5'上流域中には存在しないことが明らかになった。現在、サウス-ウェスタン法を用いてHepG2細胞由来の核蛋白質中のA-activator結合部位およびInterferon-γ反応性エレメント結合蛋白質のクローニングを行うとともに、遺伝子歩行(gene walking)法を用いてPCI遺伝子のさらに上流を単離し、Lucをレポーター遺伝子としてPMA反応性エレメントの同定を行っている。

蛋白 C 抑制剂 (PCI) 是一种针对凝血调节剂活化蛋白 C (APC) 的特异性血浆抑制剂，是血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂 (SERPIN) 蛋白家族的成员，其结构与 α1 抗胰蛋白酶同源。这是一个。另外，精浆中的PCI浓度比血浆高约40倍，在男性不育症患者的精浆中浓度显着降低，提示与此相关。迄今为止，在这项令人鼓舞的研究的支持下，我们已经研究了肝（HepG2）细胞中 PCI 基因的表达调控区域，包括作为启动子的 Sp1 结合位点（-302 至 -294 残基），以及两个AP2结合位点，Spl结合位点上游的AP2结合位点（残基-350至-343）充当增强子，A激活剂结合位点（残基-422至-414）和干扰素-γ响应元件（残基-164至-157）充当沉默子，并且Sp1结合位点下游的AP2结合位点使用荧光素酶（Luc）作为报告基因，我们发现该蛋白质没有功能。此外，使用源自 HepG2 细胞的核蛋白的凝胶迁移率变化分析表明，源自 HepG2 的 Spl 和 AP2 分别与 Sp1 结合位点和上游 AP2 结合位点结合，并且 A 激活剂结合位点和我们揭示了以前未知的核蛋白与干扰素γ反应元件结合。此外，HepG2细胞中PC1的表达在转录水平上被强致癌启动子佛波醇乙酸酯(PMA)抑制，并且PMA响应元件位于PCI基因It的约1.6kb 5'上游区域。结果里面一个人也没有。目前，我们正在使用South-West法克隆来自HepG2细胞的核蛋白中的A激活剂结合位点和干扰素-γ反应元件结合蛋白，并且我们正在使用基因行走方法克隆更上游的PCI基因。分离并使用 Luc 作为报告基因鉴定了 PMA 响应元件。

项目成果

Hayashi,T.: "Regulation of the human protein C inhibitor gene expression in HepG2 cells:Role of Sp1 and AP2." Biochem.J.(in press).

Hayashi,T.：“HepG2 细胞中人类 C 蛋白抑制剂基因表达的调节：Sp1 和 AP2 的作用。”

Hayashi,T.: "Regulation of the human protein C inhibitor gene expression in HepG2 cells: Role of Sp1 and AP2." Biochem.J.372. 573-582 (1998)

Hayashi,T.：“HepG2 细胞中人类 C 蛋白抑制剂基因表达的调节：Sp1 和 AP2 的作用。”

Nishioka,J.: "Protein C Inhibitor secreted from activated platelets efficiently inhibits activated protein C on phosphatidylethanolamine of platelet membrane and microvesicles." J.Biol. Chem.(in press).

Nishioka,J.：“活化血小板分泌的蛋白 C 抑制剂可有效抑制血小板膜和微泡磷脂酰乙醇胺上的活化蛋白 C。”

Usui,M.: "Molecular cloning, expression and tissue distribution of canine lipopolysaccharide(LPS)-binding protein." Biochim. Biophys. Acta. (in press).

Usui,M.：“犬脂多糖（LPS）结合蛋白的分子克隆、表达和组织分布。”

Wakita,T.: "Molecular cloning,tissue distribution and androgen regulation of rat protein C inhibitor." FEBS.Lett.429. 263-268 (1998)

Wakita,T.：“大鼠蛋白 C 抑制剂的分子克隆、组织分布和雄激素调节。”