バキュロウイルスを用いた組換えMJD蛋白発現系と構造解析

重组MJD蛋白表达系统及杆状病毒结构分析

• 批准号: 09770438
• 负责人: 中村 浩一郎
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770438/
• 关键词: Machado-Joseph病(MJD); ポリグルタミン; 神経細胞死; バキュロウィルス; 陰イオン交換クロマトグラフィー; 金属アフィニティークロマトグラフィー; 疎水性クロマトグラフィー; バキュロウイルス; DRPLA; MJD(Machado-Joseph Disease); Histidine-Tag; イオン交換クロマトグラフィーカラム; 疎水性クロマトグラフィーカラム; キレ-テイングクロマトグラフィーカラム

【目的】Machado-Joseph病(以下MJD)は、現在まで8つ知られているポリグルタミン病のひとつである。それらの疾患の神経細胞死の分子メカニズムはまだ解明されていない。我々は、バキュロウイルス発現系を用いて、正常型および伸長したポリグルタミンを持つ異常型MJD蛋白を大量に作成し、この両者の生化学的性質および三次構造を比較検討することを目的として精製を試みた。【方法】我々はMJD蛋白のN末にHis-Tagをつけた組換え蛋白を作成した。大規模精製の前に条件を検討するため小規模精製を行った。組換え蛋白を発現している昆虫細胞をAIEX bufferに縣濁の後、超音波破砕した。これを超遠心した上清をサンプルとし、陰イオン交換カラム(Resource 15Q PE4.6/100)にapplyした。5mM〜1 M NaCl濃度勾配にて溶出したfractionを抗His-Tag抗体を用いたWBにて確認した。次に、その陽性fractionをNi-Resinに吸着させバッチ法を用いて溶出した。その陽性fractionを疎水性カラム(Resource ISOを用いて溶出した。【結果および考察】精製の過程で、正常型と異常型組換えMJD蛋白に、陰イオン交換体、および疎水性リガンドとの結合強度に有意な差は見いだせなかった。異常型のポリグルタミン鎖とその近傍の配列をもつ融合蛋白は、正常型に比較して凝集傾向が著明であるとされているが、我々の実験でも長期の4℃保存状態では、より異常型の組換えNUD蛋白溶液の方が白濁する傾向がみられ凝集しやすいものと考えられた。また溶液の蛋白濃度が高い方がより白濁しやすい傾向が見られた。このことは、Perutzらが提唱したポリグルタミンドメインは互いに水素結合を介して、非共有結合的に自己凝集して逆平行βシートを形成するという説を支持すると思われた。

[目的]马查多-约瑟夫病(MJD)是迄今为止已知的八种聚谷氨酰胺疾病之一。这些疾病中神经细胞死亡的分子机制尚未阐明。我们使用杆状病毒表达系统产生大量具有扩展的聚谷氨酰胺的正常和异常MJD蛋白，并纯化它们以比较和检查它们的生化特性和三级结构。 [方法] 我们创建了一种重组蛋白，其 MJD 蛋白的 N 末端带有 His 标签。进行小规模纯化以检查大规模纯化之前的条件。将表达重组蛋白的昆虫细胞悬浮在 AIEX 缓冲液中，然后通过超声波破碎。将其超速离心，并将上清液用作样品并施加至阴离子交换柱（资源15Q PE4.6/100）。使用抗-His-Tag 抗体通过 WB 确认用 5mM 至 1M NaCl 浓度梯度洗脱的级分。接下来，将阳性部分吸附到Ni-Resin上并使用分批方法洗脱。将阳性部分转移至疏水柱（资源[结果与讨论] 在纯化过程中，正常型和异常型重组MJD蛋白与阴离子交换剂和疏水性配体的结合强度没有显着差异。具有异常类型的聚谷氨酰胺链及其邻近序列的蛋白质与正常类型相比具有明显的聚集倾向，但在我们的实验中，融合蛋白在4℃下长时间保存时具有明显的聚集倾向。结果发现，异常的重组NUD蛋白溶液有变得浑浊的倾向，并且被认为更容易聚集。这也表明具有较高蛋白浓度的溶液更容易变得浑浊，这似乎支持了这一点。 Perutz等人提出的理论，聚谷氨酰胺域通过氢键非共价自聚集形成反平行的β-折叠。

项目成果

羽関 典子・中村 浩一郎: "ポリグルタミン異常伸長と核内封入体-CAGリピート研究の新展開-" 脳の科学. 20. 913-916 (1998)

Noriko Uzeki 和 Koichiro Nakamura：“异常聚谷氨酰胺扩张和核内含物 - CAG 重复研究的新进展”《脑科学》20. 913-916 (1998)。

中村 浩一郎・金澤 一郎: "ポリグルタミン病の神経細胞死とその分子メカニズム" 医学のあゆみ 神経細胞死制御. 別冊. 7-11 (1998)

Koichiro Nakamura 和 Ichiro Kanazawa：“多聚谷氨酰胺疾病中的神经细胞死亡及其分子机制”《神经细胞死亡控制史》7-11（1998）。

Koichiro Nakamura,et al.: "Rapid aggregate formation of the huntingtin N-terminal fragment carrying an expanded polyglutamine tract." Biochem.Biophys.Res.Com.(in press).

Koichiro Nakamura 等人：“携带扩展的聚谷氨酰胺束的亨廷顿蛋白 N 末端片段的快速聚集形成。”