バキュロウイルスを用いた組換えMJD蛋白発現系と構造解析

重组MJD蛋白表达系统及杆状病毒结构分析

• 批准号: 09770438
• 负责人: 中村 浩一郎
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770438/
• 关键词: Machado-Joseph病(MJD); ポリグルタミン; 神経細胞死; バキュロウィルス; 陰イオン交換クロマトグラフィー; 金属アフィニティークロマトグラフィー; 疎水性クロマトグラフィー; バキュロウイルス; DRPLA; MJD(Machado-Joseph Disease); Histidine-Tag; イオン交換クロマトグラフィーカラム; 疎水性クロマトグラフィーカラム; キレ-テイングクロマトグラフィーカラム

【目的】Machado-Joseph病(以下MJD)は、現在まで8つ知られているポリグルタミン病のひとつである。それらの疾患の神経細胞死の分子メカニズムはまだ解明されていない。我々は、バキュロウイルス発現系を用いて、正常型および伸長したポリグルタミンを持つ異常型MJD蛋白を大量に作成し、この両者の生化学的性質および三次構造を比較検討することを目的として精製を試みた。【方法】我々はMJD蛋白のN末にHis-Tagをつけた組換え蛋白を作成した。大規模精製の前に条件を検討するため小規模精製を行った。組換え蛋白を発現している昆虫細胞をAIEX bufferに縣濁の後、超音波破砕した。これを超遠心した上清をサンプルとし、陰イオン交換カラム(Resource 15Q PE4.6/100)にapplyした。5mM〜1 M NaCl濃度勾配にて溶出したfractionを抗His-Tag抗体を用いたWBにて確認した。次に、その陽性fractionをNi-Resinに吸着させバッチ法を用いて溶出した。その陽性fractionを疎水性カラム(Resource ISOを用いて溶出した。【結果および考察】精製の過程で、正常型と異常型組換えMJD蛋白に、陰イオン交換体、および疎水性リガンドとの結合強度に有意な差は見いだせなかった。異常型のポリグルタミン鎖とその近傍の配列をもつ融合蛋白は、正常型に比較して凝集傾向が著明であるとされているが、我々の実験でも長期の4℃保存状態では、より異常型の組換えNUD蛋白溶液の方が白濁する傾向がみられ凝集しやすいものと考えられた。また溶液の蛋白濃度が高い方がより白濁しやすい傾向が見られた。このことは、Perutzらが提唱したポリグルタミンドメインは互いに水素結合を介して、非共有結合的に自己凝集して逆平行βシートを形成するという説を支持すると思われた。

[目的] Machado-Joseph氏病（以下称为MJD）是迄今已知的八种已知的聚谷氨酰胺疾病之一。这些疾病中神经元死亡的分子机制尚未阐明。我们使用杆状病毒表达系统创建了大量具有正常和扩展聚谷氨酸的异常MJD蛋白，并尝试进行纯化，以比较两者的生化特性和三级结构。方法我们创建了一种重组蛋白，并带有HIS标签，该蛋白附着在MJD蛋白的N末端。在大规模纯化之前进行小规模的纯化以检查条件。将表达重组蛋白的昆虫细胞悬浮在AIEX缓冲液中，然后进行超声波化。这是超离心的上清液作为样品，并应用于阴离子交换柱（资源15Q PE4.6/100）。使用抗HIS-TAG抗体，使用WB确认了用5 mm至1 M NaCl浓度洗脱的分数。然后将正分数吸附到Ni-asin上，并使用批处理方法洗脱。使用疏水柱（资源ISO）洗脱正分数。 [结果和讨论]在纯化过程中，发现正常和异常重组MJD蛋白之间的结合强度没有显着差异。尽管据说，异常的聚谷氨酰胺链和周围序列对融合蛋白具有显着的聚集趋势，融合蛋白具有异常的聚谷氨酰胺链及其周围序列，而与正常类型相比，在我们的实验中，人们认为这种异常的再构成蛋白质蛋白溶液会变得更有可能成为云层，并且更有可能成为云云。此外，发现溶液中的蛋白质浓度越高。人们认为这支持了Perutz等人提出的聚谷氨酰胺结构域的理论。通过氢键相互键合，形成反平行的β板，从而自我聚集。

项目成果

羽関 典子・中村 浩一郎: "ポリグルタミン異常伸長と核内封入体-CAGリピート研究の新展開-" 脳の科学. 20. 913-916 (1998)

Noriko Uzeki 和 Koichiro Nakamura：“异常聚谷氨酰胺扩张和核内含物 - CAG 重复研究的新进展”《脑科学》20. 913-916 (1998)。

中村 浩一郎・金澤 一郎: "ポリグルタミン病の神経細胞死とその分子メカニズム" 医学のあゆみ 神経細胞死制御. 別冊. 7-11 (1998)

Koichiro Nakamura 和 Ichiro Kanazawa：“多聚谷氨酰胺疾病中的神经细胞死亡及其分子机制”《神经细胞死亡控制史》7-11（1998）。

Koichiro Nakamura,et al.: "Rapid aggregate formation of the huntingtin N-terminal fragment carrying an expanded polyglutamine tract." Biochem.Biophys.Res.Com.(in press).

Koichiro Nakamura 等人：“携带扩展的聚谷氨酰胺束的亨廷顿蛋白 N 末端片段的快速聚集形成。”