新しいポリグルタミン病SCA17(TBP病)のモデル動物系の作成と分子病態解析

新型多聚谷氨酰胺病SCA17（TBP病）模型动物系统的建立及分子病理学分析

• 批准号: 14017019
• 负责人: 中村 浩一郎
• 金额: $ 4.42万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14017019/
• 关键词: ポリグルタミン病; モデル動物; SCA17; TATA結合蛋白; 痴呆; 小脳症状; トランスジェニック; 線虫

(1)トランスジェニック線虫の作成初期の実験で作成したトランスジェニック線虫は効率よく表現型を示さなかったので、実験法に改良を加えた。具体的には線虫の神経細胞特異的に発現するH20プロモータ下流に全長ヒトTBP遺伝子を繋いだコンストラクトPpD49.26(H20)-TBP_Q37、Q56、Q93、Q168、Q199をマーカー遺伝子dpy-20とともにdumpy mutantにトランスフェクションし、dpy表現型がrescueされる事を利用してトランスジェニック線虫を作成した。dpy-20のみ、各Q37、Q56、Q93、Q168、Q199とdpy-20をトランスフェクションしたtransgenic lineを各12ラインづつ得た。幼若線虫(L1〜L4)、成虫早期には各ライン間には行動異常・形態異常は認められなかった。しかしながらその後の解析により、低頻度(15%)ながらQ93〜Q199ラインにおいて、非常に強いlocomotion障害およびegg laying defectの表現型が観察される事を確認した。Nose touch testでは明らかに後退しない個体を認めた。現在Dye filling test(ASH neuron assay)、化学走性(chemotaxis assay)に関して検討を行っている。一方抗ヒトTBPN末モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討では、dpyラインでは線虫のauthentic TBPは染色されず、Q37ラインでは発現したヒトTBPにより神経細胞核が瀰漫性に染色された。これに対してQ199ラインでは神経細胞核の瀰漫性染色性は失われ、核内あるいは核近傍の細胞質内に凝集体を認めた。以上よりQ93〜特異的に核内あるいは細胞質内凝集体を有し、強い運動障害表現型を呈するポリグルタミン病モデルを作成したものと考えた。上記の結果を32th Annual meeting of Society for Neuroscience,2002(USA)にて発表した。(2)コンディショナルトランスジェニックマウスの作成Q199 transgenicマウスを現在5株樹立した。現在これらのマウスの胚細胞導入を確認中である。Q37 ransgenicマウスに関しては初回のinjectionにてtransgeneが確認できなかったので再度iinjectionを行ったところである。一方これらのtransgenicマウスと交配する予定のTet-Offマウスはジャクソン研究所より購入し、外注施設内にて現在継代繁殖中である。今後Q199/37 transgenicラインのSouthernblotを行い、全長のhuman TBPが確実にintegradeされている事およびtransgeneのコピー数の確認を行った後、Tet-Offマウスと交配し、表現型を確認する予定である。

(1)转基因线虫的创建由于早期实验产生的转基因线虫未能有效地表现出表型，我们对实验方法进行了改进。具体来说，构建体 PpD49.26(H20)-TBP_Q37、Q56、Q93、Q168 和 Q199 将全长人类 TBP 基因连接到在秀丽隐杆线虫神经元中特异性表达的 H20 启动子下游，与我们通过转染突变体并利用 dpy 表型被拯救的事实来创建转基因线虫。仅对于 dpy-20，通过转染 Q37、Q56、Q93、Q168、Q199 和 dpy-20 获得 12 个转基因系。幼年线虫（L1 至 L4）和早期成虫系之间未观察到行为或形态异常。然而，随后的分析证实，在 Q93-Q199 品系中观察到非常强烈的运动障碍和产蛋缺陷表型，尽管频率较低（15%）。在鼻子接触测试中，观察到一些个体明显没有退缩。我们目前正在研究染料填充试验（ASH 神经元测定）和趋化性测定。另一方面，在使用抗人TBPN终止单克隆抗体的免疫组织化学研究中，dpy系中线虫的真实TBP未被染色，而Q37系中神经元核被表达的人TBP广泛染色。相反，在Q199系中，神经元细胞核的弥散染色消失，并且在细胞核内或细胞核附近的细胞质内观察到聚集体。基于上述，我们相信我们已经创建了一种多聚谷氨酰胺疾病模型，该模型具有Q93特异性核或细胞质聚集体，并表现出强烈的运动障碍表型。上述结果发表在2002年第32届神经科学学会年会上（美国）。 (2)条件转基因小鼠的创建目前我们已经建立了5个品系的Q199转基因小鼠。我们目前正在确认将胚胎细胞引入这些小鼠体内。 Q37 对于转基因小鼠，第一次注射无法确认转基因，所以我们再次注射。另一方面，计划与这些转基因小鼠杂交的 Tet-Off 小鼠是从杰克逊实验室购买的，目前正在外包设施中进行传代培养。我们计划对 Q199/37 转基因系进行 Southern 印迹，以确认全长人类 TBP 已整合以及转基因的拷贝数，然后将其与 Tet-Off 小鼠杂交以确认表型。

项目成果

Hazeki N, et al.: "Ultrastructure of nuclear aggregates formed by expressing an expanded polyglutamine"Biochem Biophys Res Commun. 294(2). 429-440 (2002)

Hazeki N 等人：“通过表达扩展的聚谷氨酰胺形成的核聚集体的超微结构”Biochem Biophys Res Commun。