牛の黄体発育過程におけるLH受容体のスプライシング異型体の発現と機能

牛黄体发育过程中 LH 受体剪接变异体的表达和功能

基本信息

批准号：
09760272
负责人：
川手憲俊
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka Prefecture University (1998)Yamaguchi University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

牛の黄体における黄体形成ホルモン(LH)受容体mRNAのスプライシング異型体の発現についてRT-PCR法により検討し、さらに準定量的RT-PCR法を用いて黄体発育過程におけるその量的変化について検討した。また牛LH受容体異型体の機能について検討する目的で完全長cDNAのクローニングを行った。RT-PCRによって得られた増幅産物は明瞭な4本のバンドから構成されており、その塩基配列については最長のバンドは全長型(A form)で牛LH受容体cDNAの当該領域の配列と同一であった。残りの3本のバンドは、LH受容体mRNAの異型体であった(F、BおよびG formと命名)。4種のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に増加した。また、牛のLH受容体の完全長cDNAのクローニングをRT-PCR法を用いて実施した。RT-PCRは3つの断片に分けて行い、その後3つの断片を制限酵素による切断後、DNAリガーゼによりつなぎ合わせて、4種の完全長cDNA(A,F,BおよびG form)を得た。それらの塩基配列を決定した結果、F formは細胞外のLHと結合する領域の短い部分のみが欠失しており、細胞膜貫通領域および細胞内領域はA formと同一であることがわかった。B formについてはmRNAの一部欠失によるアミノ酸読み枠の移動が起こり、そのため膜貫通領域および細胞内領域を持たない異型体であることが明らかになった。またG formについては、B formの細胞外領域の一部がF formと同様に欠失したものであることがわかった。得られたLH受容体の4種の全長cDNAは哺乳動物発現用のベクターに組み換えて、猿腎臓由来の細胞株に遺伝子導入を行い、その機能について現在解析中である。以上の成績から、牛のLH受容体mRNAのスプライシング異型体は少なくとも3種類存在し(F,BおよびG form)、さらに4種類のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に参加することが示唆された。またその3種類の異型体は細胞外領域の一部のみが欠失するもの(F form)、膜貫通領域および細胞内領域が完全に欠損するもの(BおよびG form)であることが明らかになった。

我们利用RT-PCR研究了黄体生成素（LH）受体mRNA剪接变异体在牛黄体中的表达，并利用半定量RT-PCR进一步研究了其在黄体发育过程中的数量变化。此外，还克隆了全长 cDNA 以研究牛 LH 受体变体的功能。 RT-PCR获得的扩增产物由4个不同的条带组成，最长的条带是全长形式（A形式），其与牛LH受体cDNA的相关区域的序列相同。其余三个条带是 LH 受体 mRNA 的变体（称为 F、B 和 G 形式）。四个物种的 mRNA 水平在黄体发育过程中以几乎相同的方式增加。此外，使用RT-PCR克隆了牛LH受体的全长cDNA。对三个片段进行RT-PCR，然后用限制性内切酶切割这三个片段并用DNA连接酶连接在一起以获得四种类型的全长cDNA（A、F、B和G形式）。确定其核苷酸序列的结果发现，F型仅缺少一小部分与胞外LH结合的区域，跨膜区和胞内区与A型相同。 B型由于mRNA的部分缺失而发生了氨基酸阅读框的偏移，因此可知其是不具有跨膜区域和细胞内区域的非典型型。关于G型，发现B型的部分胞外区被删除，与F型类似。将获得的四种LH受体的全长cDNA重组至哺乳动物表达载体中，并将基因导入猴肾来源的细胞系中，目前正在分析其功能。上述结果表明，牛LH受体mRNA至少存在三种剪接变异体（F、B和G形式），并且四种mRNA的量几乎均等地参与黄体发育过程。还揭示了这三种变体是一种仅部分细胞外区域被删除的变体（F形式），以及一种其中跨膜区域和细胞内区域被完全删除的变体（B和G形式）。