牛の黄体発育過程におけるLH受容体のスプライシング異型体の発現と機能

牛黄体发育过程中 LH 受体剪接变异体的表达和功能

基本信息

批准号：
09760272
负责人：
川手憲俊
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka Prefecture University (1998)Yamaguchi University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

牛の黄体における黄体形成ホルモン(LH)受容体mRNAのスプライシング異型体の発現についてRT-PCR法により検討し、さらに準定量的RT-PCR法を用いて黄体発育過程におけるその量的変化について検討した。また牛LH受容体異型体の機能について検討する目的で完全長cDNAのクローニングを行った。RT-PCRによって得られた増幅産物は明瞭な4本のバンドから構成されており、その塩基配列については最長のバンドは全長型(A form)で牛LH受容体cDNAの当該領域の配列と同一であった。残りの3本のバンドは、LH受容体mRNAの異型体であった(F、BおよびG formと命名)。4種のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に増加した。また、牛のLH受容体の完全長cDNAのクローニングをRT-PCR法を用いて実施した。RT-PCRは3つの断片に分けて行い、その後3つの断片を制限酵素による切断後、DNAリガーゼによりつなぎ合わせて、4種の完全長cDNA(A,F,BおよびG form)を得た。それらの塩基配列を決定した結果、F formは細胞外のLHと結合する領域の短い部分のみが欠失しており、細胞膜貫通領域および細胞内領域はA formと同一であることがわかった。B formについてはmRNAの一部欠失によるアミノ酸読み枠の移動が起こり、そのため膜貫通領域および細胞内領域を持たない異型体であることが明らかになった。またG formについては、B formの細胞外領域の一部がF formと同様に欠失したものであることがわかった。得られたLH受容体の4種の全長cDNAは哺乳動物発現用のベクターに組み換えて、猿腎臓由来の細胞株に遺伝子導入を行い、その機能について現在解析中である。以上の成績から、牛のLH受容体mRNAのスプライシング異型体は少なくとも3種類存在し(F,BおよびG form)、さらに4種類のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に参加することが示唆された。またその3種類の異型体は細胞外領域の一部のみが欠失するもの(F form)、膜貫通領域および細胞内領域が完全に欠損するもの(BおよびG form)であることが明らかになった。

通过RT-PCR研究了牛体中叶酸激素（LH）受体mRNA的剪接形式的表达，并通过RT-PCR进行了研究，并使用准定量RT-PCR方法进一步研究了叶黄素发育的定量变化。另外，克隆全长cDNA以研究牛LH受体非典型基因型的功能。通过RT-PCR获得的扩增产物由四个不同的带组成，最长的带为全长（一种形式），与牛LH受体cDNA区域的序列相同。其余的三个频段是LH受体mRNA的异形（指定的F，B和G形式）。在黄体发育过程中，这四个物种中的mRNA量增加了。另外，使用RT-PCR进行牛LH受体的全长cDNA的克隆。将RT-PCR分为三个片段，然后用限制酶裂解三个片段，然后与DNA连接酶一起连接以获得四个全长CDNA（A，F，B和G形式）。确定了它们的基本序列，发现F形式仅在与细胞外LH结合的区域的短部分中删除，并且跨膜和细胞内区域与形式相同。对于B形式，由于mRNA的部分缺失而移动氨基酸的读数框架，因此发现它是一种非典型形式，没有跨膜或细胞内区域。此外，发现B形式的细胞外区域的一部分与F形式类似。将所获得的LH受体的四个全长cDNA与哺乳动物表达的载体重新组合，并将基因转移到源自猴肾脏的细胞系中，目前正在分析其功能。这些结果表明，存在至少三种类型的剪接非典型LH受体mRNA（F，B和G形式），并且在黄体开发过程中，四种mRNA的量几乎以相同的方式参与。还揭示了这三种非典型形态是仅在细胞外区域（F形式）中被删除的三种类型的形态，而在跨膜和细胞内区域中完全不足的形态（B形式）（B和G形式）。