糸球体上皮細胞表面に存在する蛋白尿惹起分枝p51のクローニング

肾小球上皮细胞表面蛋白尿诱导分支p51的克隆

基本信息

批准号：
08770878
负责人：
河内裕
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白尿惹起性モノクローナル抗体(mAb)5-1-6認識抗原p51のクローニングのため、まずラット糸球体libraryを作成した。p51の成熟ラットでの合成は極めて微量で、まだ糸球体形成が続いている幼若ラットでは活発な合成があることをmetabolic labelingの系で証明しているので、生後1日令ラット糸球体からmRNAを抽出し、λexloxベクターでのlibrary、COScell expresion用のpcDNAベクターを用いたlibraryを作成し、それぞれ300万cloneをscreeningした。一次、二次screeningで3個の陽性cloneを分離し、現在sequencing、homology検索を続けている。p51は、peroxidaseを用いた免疫電顕法で糸球体上皮細胞足突起表面、並びに足突起間に分布しているのが証明されているが、より正確に局在を同定するため金粒子を用いた免疫電顕法でその局在をZO-1と比較し、半定量的検討した。ZO-1 は足突起側部表面のスリット膜が突き出る点に局在するのに対し、p51は主に足突起間(2.14コ金粒子/μm基底膜)に存在し、スリット膜上に線状に分布しているのを観察した。また蛋白尿の発症メカニズムをin vivo並びに単離糸球体を用いたex vivoの系で検討した。mAb5-1-6による蛋白尿発症時、p51並びに、ZO-1の発現量が著明に減少していること、そしてこれらの変化はtyrosinのリン酸化を伴わない現象であるということを免疫組織学的手法、Western blot法で証明した。またこれらの分子の変化は、Ca^<++>dependentのcalmodulin-cytoskeltonを介した現象であることを証明した。今後は、p51のクローニングを続け、p51,ZO-1発現低下のメカニズムをex vivoの系でより詳細に検討していく予定である。これらの分子の動態の詳細な検討は、蛋白尿発症機序の解明のみならず、未だ未解決な部分の多いスリット膜の構造、機能の解明につながるものと考えられる。

为了克隆蛋白尿单克隆抗体（MAB）5-1-6识别抗原p51，首先创建了大鼠肾小球文库。 The synthesis of p51 in mature rats was extremely small, and the metabolic labeling system proved that there was active synthesis in young rats that are still continuing glomerulosal formation, so mRNA was extracted from the glomerulus of one-day-old rats, and libraries were created using the λexlox vector and pcDNA vector for COScell expression, and 3 million clones were screened each.通过初级和次要筛选分离了三个正阳性克隆，目前正在继续进行测序和同源性搜索。已经证明，使用过氧化物酶通过免疫电子显微镜在脚和脚过程之间分布p51，但是为了更准确地识别其定位，使用金颗粒将其定位与ZO-1与ZO-1进行了比较，并使用金颗粒进行了免疫电子显微镜，并进行了半频繁的检查。 ZO-1位于脚突出的狭缝膜的突出点，而p51主要存在于脚突起（2.14 COG金颗粒/μm地下膜）之间，并在裂隙膜上线性性分布。还使用分离的肾小球在体内和离体系统中研究了蛋白尿发作的机制。免疫组织化学方法蛋白质印迹表明，在由MAB5-1-6引起的蛋白尿发作时，p51和ZO-1的表达水平显着降低，并且这些变化不伴有酪氨酸的磷酸化。我们还证明了这些分子变化是由Ca^<++>依赖性的Calmolin-Cytoskelton介导的。将来，我们将继续克隆p51并进一步研究降低p51，ZO-1表达的机制。人们认为对这些分子的动力学的详细检查不仅会导致阐明蛋白尿发育机制，而且还导致阐明裂隙膜的结构和功能，这些机制仍未解决。