糸球体上皮細胞表面に存在する蛋白尿惹起分枝p51のクローニング

肾小球上皮细胞表面蛋白尿诱导分支p51的克隆

基本信息

批准号：
08770878
负责人：
河内裕
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白尿惹起性モノクローナル抗体(mAb)5-1-6認識抗原p51のクローニングのため、まずラット糸球体libraryを作成した。p51の成熟ラットでの合成は極めて微量で、まだ糸球体形成が続いている幼若ラットでは活発な合成があることをmetabolic labelingの系で証明しているので、生後1日令ラット糸球体からmRNAを抽出し、λexloxベクターでのlibrary、COScell expresion用のpcDNAベクターを用いたlibraryを作成し、それぞれ300万cloneをscreeningした。一次、二次screeningで3個の陽性cloneを分離し、現在sequencing、homology検索を続けている。p51は、peroxidaseを用いた免疫電顕法で糸球体上皮細胞足突起表面、並びに足突起間に分布しているのが証明されているが、より正確に局在を同定するため金粒子を用いた免疫電顕法でその局在をZO-1と比較し、半定量的検討した。ZO-1 は足突起側部表面のスリット膜が突き出る点に局在するのに対し、p51は主に足突起間(2.14コ金粒子/μm基底膜)に存在し、スリット膜上に線状に分布しているのを観察した。また蛋白尿の発症メカニズムをin vivo並びに単離糸球体を用いたex vivoの系で検討した。mAb5-1-6による蛋白尿発症時、p51並びに、ZO-1の発現量が著明に減少していること、そしてこれらの変化はtyrosinのリン酸化を伴わない現象であるということを免疫組織学的手法、Western blot法で証明した。またこれらの分子の変化は、Ca^<++>dependentのcalmodulin-cytoskeltonを介した現象であることを証明した。今後は、p51のクローニングを続け、p51,ZO-1発現低下のメカニズムをex vivoの系でより詳細に検討していく予定である。これらの分子の動態の詳細な検討は、蛋白尿発症機序の解明のみならず、未だ未解決な部分の多いスリット膜の構造、機能の解明につながるものと考えられる。

为了克隆蛋白尿诱导单克隆抗体（mAb）5-1-6识别抗原p51，首先构建了大鼠肾小球文库。 p51 在成年大鼠中的合成量极少，但在肾小球仍在形成的年轻大鼠中，我们使用代谢标记系统提取了 mRNA，使用 λexlox 载体创建了一个文库，并使用 pcDNA 载体创建了一个文库。 COScell表达，并筛选了各300万个克隆。我们通过初筛和二次筛选分离出三个阳性克隆，目前正在继续测序和同源性搜索。使用过氧化物酶的免疫电镜已经证明p51分布在肾小球上皮细胞的足突表面和足突之间，但为了更精确地识别定位，我们使用金颗粒将其定位进行了比较。利用免疫电镜对ZO-1进行了半定量研究。 ZO-1位于足突侧面狭缝膜的突出点，而p51主要存在于足突之间（2.14金颗粒/μm基底膜），并以线状位于狭缝上观察到分布在膜中。我们还使用分离的肾小球研究了体内和离体蛋白尿的机制。免疫系统显示，在mAb5-1-6引起的蛋白尿发作期间，p51和ZO-1的表达水平显着降低，并且这些变化是不伴随酪氨酸磷酸化的现象。科学方法，蛋白质印迹法。我们还证明这些分子变化是由Ca^++依赖性钙调蛋白-细胞骨架介导的。未来，我们计划继续克隆p51，并在离体系统中更详细地研究p51和ZO-1表达减少的机制。对这些分子动力学的详细研究不仅将阐明蛋白尿的发病机制，而且还将阐明缝膜的结构和功能，这仍然有许多未解决的方面。