がん樹状細胞ワクチン療法における免疫モニタリング法の確立と臨床への応用

癌症树突状细胞疫苗治疗免疫监测方法的建立及临床应用

• 批准号: 23931034
• 负责人: 樋口 由美子
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23931034/
• 关键词: 樹状細胞療法; MLPC法; テトラマー解析

1)MLPC(Mixed Lymphocyte-PeptideCulture)法の条件の確立(1)健常人末梢血単核球(PBMC)にサイトメガロウイルス(CMV)ペプチドを添加し10%ウシ血清アルブミン(BSA)またはヒトAB血清(HSAB)添加培地で2週間培養した後、テトラマー解析にてCMV特異的CTLを測定した。BSA添加培地では細胞障害性T細胞(CTL)未検出であったが、HSAB添加培地では高頻度に検出された。ゆえに添加血清はHSABが適当と思われた。(2)96wellプレート1wellあたり1×10^5、2×10^5の細胞数にてMLPCを行い、2週間後にテトラマー解析を行った。1×10^5では28well中7wellでCTLを確認したのに対し、2×10^5では14well中全てのwellでCTLを確認した。また、2×10^5では1×10^5に比較して、1wellのテトラマー陽性率が高かった。このことから、2×10^5の播種ではCTLが1well中2個以上存在する可能性が考えられた。ゆえに、より正確にCTLを測定するためには、1wellあたり1×10^5が適当と思われた。(3)5、10、20μMの3濃度の抗原ペプチドを添加してそれぞれMLPCを行った。培養2週間後にテトラマー解析にてCTLを測定した。その結果誘導出来たCD8陽性T細胞中のCTL数は、それぞれ8.4×10^<-6>、10.5×10^<-6>、4.2×10^<-6>であり、10μMが最も誘導率が高かった。2)臨床への応用現行法ではCTLが検出されない患者PBMCを用いて、MLPC後にTetramer解析を行った。ワクチン投与前ではCTLが確認できなかったが、投与7回ではCD8陽性T細胞中6.8×10^<-6>、投与15回では12.3×10^<-6>とCTLが増加していた。MLPC法により、患者末梢血中のCTLの検出率を上げることが可能となった。

1）MLPC（混合淋巴细胞肽培养基）条件（1）健康流行的Hydrophol核捕获（PBMC）10％capenemine白蛋白（BSA）或人类AB血清在培养后培养两周后，将其添加到肽（CMV）中。在添加的培养基中，在四分法分析中测量了CMV特异性CTL。在BSA添加的培养基中，未检测到细胞疾病T细胞（CTL），但在HSAB附加土地中经常被检测到。因此，HSAB似乎适合添加剂血清。 （2）MLPC用1×10^5的细胞数量和每条井96板板1宿的细胞数量进行，两周后，进行了四项分析。在1x10^5中，CTL在28Well的7Well中得到了证实，而CTL在2x15的14 Well上得到了确认。另外，1Well四元正率在2x10^5中高于1x10^5。由此，可以认为2×10^5播种可能有两个或更多的CTL。因此，为了更准确地测量CTL，1x10^5被认为是合适的。 （3）MLPC通过添加5、10和20μM的三浓度抗原肽进行。培养后两周，通过四摩尔分析测量CTL。结果，可以引导的CD8阳性T细胞中的CTL数量为8.4×10^<-6>，10.5×10^<-6>，4.2×10^<-6>和10μm是最高的速度。 2）应用于临床实践，使用MLPC使用PBMC进行四聚体分析，该PBMC在当前定律中未检测到CTL。在疫苗给药之前无法确认CTL，但是CD8阳性T细胞的数量为6.8×10^<-6>在CD8阳性T细胞中增加到12.3×10^<-6>。 MLPC方法使外周血中CTL的检测率提高了。