高等真核生物におけるDNA複製阻害遺伝子の単離

高等真核生物中 DNA 复制抑制基因的分离

• 批准号: 12780521
• 负责人: 小林 武彦
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780521/
• 关键词: 出芽酵母; DNA複製阻害; リボソームRNA遺伝子; 相同組み換え; Zn-フィンガー; Integrase; FOB1; DNA複製阻害点; リボゾームRNA遺伝子

DNA複製阻害点(RFB)とはDNA複製の進行を阻害する配列で、大腸菌からヒトの細胞に至る生物種で見いだされている。真核細胞でRFBはリボソームRNA反復遺伝子(rDNA)に存在し、出芽酵母での研究で、その活性には130bpからなる配列とそこに結合すると考えられる複製阻害タンパク質(Fob1p)が必須であることが見出された。RFBの生理機能としては、組み換えのホットスポットとして働いて、rDNAのコピー数の維持や老化と言った重要な生理機能に関係している。本年度は当初の研究計画の一つに挙げられていたように、Fob1pの主としてコンピュータによる解析を行ない、興味深い事実を得たので報告する。まず1次構造でFob1pと相同性のあるタンパク質は昨年度の報告にあるように出芽酵母の近縁種でのみ見つかった。そこで次に2次構造を予測し、それとの類似性を検索したところ、レトロウイルスのIntegraseが見つかってきた。Integraseはウイルスがホストのゲノムに挿入する時に働く酵素で、Fob1pに期待されるDNA結合と切断活性を有する。Integraseは主に2つのドメインを持ち、1つはZn-フィンガーモチーフでこれによりDNAと結合する。Foblpにもこのモチーフは保存されており、これを塩基置換で破壊すると、Fob1の完全欠損株と同じ表現型を示すことから、Zn-フィンガーモチーフはFob1pの機能に必須であることが示唆された。もう一つはDNAの切断反応を行なうドメインでその活性中心となるアスパラギン酸もFob1pで保存されている。現在同様の塩基置換実験を実行中である。本申請研究は今年度を持って終了するが、今後は上述のようにFob1pの生理活性が予測できたので、その精製を行ない、生化学的な解析を中心に進めていく予定である。

DNA 复制阻断点 (RFB) 是抑制 DNA 复制进程的序列，已在从大肠杆菌到人类细胞的生物物种中发现。在真核细胞中，RFB 存在于核糖体 RNA 重复基因 (rDNA) 中，对酿酒酵母的研究表明，一个 130 bp 的序列和一个被认为与其结合的复制抑制蛋白 (Fob1p) 对于其活性至关重要。发现了。 RFB的生理功能在于作为重组热点，参与rDNA拷贝数维持和衰老等重要生理功能。今年，作为最初的研究计划之一，我们主要使用计算机对Fob1p进行分析，我们将报告我们获得的一些有趣的事实。首先，正如去年报道的那样，与 Fob1p 一级结构同源的蛋白质仅在密切相关的酿酒酵母物种中发现。接下来，我们预测了二级结构并寻找与之相似的地方，找到了逆转录病毒整合酶。整合酶是一种在病毒插入宿主基因组时起作用的酶，具有Fob1p预期的DNA结合和切割活性。整合酶有两个主要结构域，其中之一是与 DNA 结合的锌指基序。该基序在 Foblp 中也是保守的，当它被碱基取代破坏时，它表现出与完全缺失的 Fob1 菌株相同的表型，表明 Zn 指基序对于 Fob1p 的功能至关重要。另一个结构域是进行DNA切割反应的结构域，其活性中心天冬氨酸在Fob1p中也是保守的。类似的碱基取代实验目前正在进行中。这项应用研究将于今年年底结束，但由于我们已经能够如上所述预测Fob1p的生理活性，因此我们计划继续其纯化和生化分析。

项目成果

Takehiko kobayashi: "Identification of DNA cis-elements essential for expansion of ribosomal DNA repeats in Saccharomyces cerevisiae"Molecular and Cellular Biology. 21. 136-147 (2001)

Takehiko kobayashi：“鉴定酿酒酵母中核糖体 DNA 重复序列扩展所必需的 DNA 顺式元件”分子和细胞生物学。

Hobert Wai: "Yeast RNA polymerase I enhancer is dispensable for transcription of the chromosomal rRNA gene and cell growth, and its apparent transcription enhancement from ectopic promoters required Fob1 protein"Molecular and Cellular Biology. 21. 5541-55

Hobert Wai：“酵母RNA聚合酶I增强子对于染色体rRNA基因的转录和细胞生长来说是可有可无的，其明显的转录增强来自异位启动子，需要Fob1蛋白”《分子与细胞生物学》。

小林 武彦: "DNA複製フォークの進行阻害と遺伝子の増幅"蛋白質・核酸・酵素. 46. 1004-1012 (2001)

Takehiko Kobayashi：“DNA 复制叉进展和基因扩增的抑制”蛋白质/核酸/酶。46. 1004-1012 (2001)