酵母リボゾームRNA遺伝子の増幅に寄与する組換えのホットスポットの検出

检测有助于酵母核糖体 RNA 基因扩增的重组热点

• 批准号: 10780430
• 负责人: 小林 武彦
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780430/
• 关键词: 酵母; リボゾームRNA遺伝子; DNA複製阻害点; 遺伝子増幅; Fob1遺伝子; 相同組み換え; ゲノムサイエンス; 老化; 分子生物学; 二本鎖切断; Fob 1遺伝子

本研究は真核細胞に普遍的に増幅して存在するリボゾームRNA反復遺伝子(rDNA)の増幅メカニズムの解明を目的に行われた。一般的に遺伝子の増幅にはその遺伝子が染色体上に整然と並ぶための組み換えのホットスポットが必須と考えられる。そこで本申請研究ではそのホットスポットとして働いていると予想されるDNA複製阻害点に着目して研究を行った。DNA複製阻害点は35SrDNAの転写終結点近傍に存在する130bpからなる配列で、35SrDNAの転写と反対方向から来るDNA複製フォークの進行のみを阻害する。昨年度までの研究の成果として、野生株で約150コピー存在するrDNAを数コピーまで減らした株をいくつか作製し、それらの株のrDNAコピー数の増幅(回復)能力を検証し、rDNAが2コピーあれば増幅が可能であることを見出した。本年度はその2コピーのrDNAに相同組み換えを利用してDNA複製阻害点(2コピーのrDNAの中間に一つ存在)をマーカー遺伝子であるURA3に置換した株を作製し、そのrDNAの増幅能力を調べた。その結果、DNA複製阻害点を持つ2コピーのrDNAの株では、45世代の培養で約80コピーまでコピー数が増加したのに対し、DNA複製阻害点をURA3に置換した株では、同じ世代培養してもその増幅は10コピー以下にとどまった(投稿準備中)。また、対照実験として行ったDNA複製阻害点のすぐ横の35S側の130bpをURA3に置換した株においては、何も置換していない元の2コピーの株とほぼ同等なコピー数の回復が見られた。以上の結果から、確かにDNA複製阻害点はrDNA中で、おそらく組み換えのホットスポットとして働き、rDNAのコピー数の増加に寄与していると結論できる。

本研究的目的是阐明核糖体 RNA 重复基因 (rDNA) 的扩增机制，该基因在真核细胞中普遍扩增。一般来说，重组热点被认为对于基因扩增至关重要，从而使基因在染色体上有序排列。因此，在这项拟议的研究中，我们重点关注有望成为热点的 DNA 复制抑制点。 DNA复制抑制点是位于35S rDNA转录终止点附近的130bp序列，仅抑制来自与35S rDNA转录相反方向的DNA复制叉的前进。截至去年的研究结果，我们创造了几种将野生菌株中存在的rDNA拷贝数减少到几个拷贝的菌株，并验证了这些菌株扩增（恢复）rDNA拷贝数的能力。我们发现，如果有拷贝，扩增是可能的。今年，我们将利用两个拷贝rDNA中的同源重组，创建一株DNA复制抑制点（位于两个拷贝rDNA之间）被标记基因URA3取代的菌株，并提高其扩增能力。我研究了一下。结果，在具有2个拷贝的rDNA且具有DNA复制抑制点的菌株中，在培养45代后拷贝数增加至大约80个拷贝，而在其中DNA复制抑制点被URA3取代的菌株中，同代培养后拷贝数增加到约80个拷贝，但扩增量仍保持在10个拷贝以下（准备提交）。另外，在作为对照实验进行的将紧邻DNA复制抑制点的35S侧的130bp替换为URA3的菌株中，拷贝数的恢复几乎与原始2拷贝的恢复相同。观察到没有任何取代的菌株。从以上结果可以得出结论，DNA复制抑制点可能作为rDNA重组的热点，并有助于rDNA拷贝数的增加。

项目成果

Takehiko KOBAYASHI: "Expansion and contraction of ribosomal DNA repeats in Saccharomyces cerevisiae : requirement of replication fork blocking (Fob1) protein and the role of RNA polymerase I"Genes and Development. 12. 3821-3830 (1998)

Takehiko KOBAYASHI：“酿酒酵母中核糖体 DNA 重复序列的扩展和收缩：复制叉阻断 (Fob1) 蛋白的要求和 RNA 聚合酶 I 的作用”基因与开发。

Takehiko KOBAYASHI: "Expansion and contraction of ribosomal DNA repeats in Saccharomyces cerevisiae: requirement of replication fork blocking (Fob 1) protein and the role of RNA polymerase" Genes and Development. 12. 3821-3830 (1998)

Takehiko KOBAYASHI：“酿酒酵母中核糖体 DNA 重复序列的扩展和收缩：复制叉阻断 (Fob 1) 蛋白的要求以及 RNA 聚合酶的作用”基因与开发。