Analysis of genomic instability caused by environmental stress

环境胁迫引起的基因组不稳定性分析

• 批准号: 21H04761
• 负责人: 小林 武彦
• 金额: $ 26.37万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-05 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H04761/
• 关键词: 環境ストレス; ゲノムの不安定性; 出芽酵母; リボソームRNA遺伝子; ヒストンの脱アセチル化酵素; ゲノム安定性; クロマチン免疫沈降法; ヒストン脱アセチル化酵素; 非コードプロモーター; 酸性培地; ゲノムの安定性; 酸性度; 寿命; 環境適応

これまでの研究で、酸性培地で酵母を培養するとゲノムの不安定領域であるリボソームRNA遺伝子（rDNA）が、安定化することを見出している。rDNAの不安定性に影響を与える要因として、１）DNA複製阻害配列での複製の停止、およびその結果生じるDNAの切断、２）非コードプロモーター（E-pro）の転写による姉妹染色分体の乖離、の２つがあげられる。これまでに、予備的ではあるが、酸性条件下ではDNA複製阻害配列での停止頻度に変化はないこと、非コードプロモーター（E-pro）の転写産物量が低下していることを見出していた。そこでデータベースから検出した転写活性に関わるヒストン修飾関連の遺伝子（59個）を選び出し、それらをノックアウトして、酸性条件下でのrDNAの安定性に与える影響を調べた。その結果、いくつかの候補遺伝子を得ることに成功し、中でも１番顕著な、つまり酸性条件下でもrDNAの安定化がみられなくなったrpd3欠損株の解析を中心に行なっている。Rpd3はヒストンの脱アセチル化酵素（HDAC）で、転写の抑制作用をもつことが知られている。作業仮説としてはRpd3が酸性条件下で、E-proの転写を抑制し、rDNAを安定化していると考えられる。当該年度はまず、酸性条件下ではDNA複製阻害配列での停止頻度に変化がないこと、非コードプロモーター（E-pro）の転写産物量が低下していることを、それぞれ二次元アガロース電気泳動法およびノーザン解析で確認した。また、酸性度に依存したRpd3のrDNAへの結合および局在の変化を、クロマチン免疫沈降法を用いて調べた。コロナ禍で研究に用いる資材、特にPCR関連の試薬の入手が困難となるなど、想定外のトラブルが生じ、繰越の上、ようやくクロマチン免疫沈降法を実施することができた。今のところはまだデータが安定しておらず、条件検討を行いながら引き続き解析を継続している。

先前的研究发现，在酸性介质中培养酵母可以稳定核糖体 RNA 基因 (rDNA)，这是基因组中的一个不稳定区域。影响 rDNA 不稳定的因素包括 1) DNA 复制抑制序列处的复制终止以及由此产生的 DNA 断裂，以及 2) 由于非编码启动子 (E-pro) 的转录导致的姐妹染色单体的分离。有两个例子：到目前为止，我们初步发现，在酸性条件下，DNA 复制抑制序列的终止频率没有变化，并且非编码启动子 (E-pro) 的转录物数量减少。因此，我们从数据库中筛选出59个与组蛋白修饰相关、参与转录活性的基因，将其敲除，并研究其在酸性条件下对rDNA稳定性的影响。结果，我们成功获得了几个候选基因，目前我们正在重点分析最突出的一个，即rpd3缺陷菌株，该菌株即使在酸性条件下也没有表现出rDNA的稳定性。 Rpd3 是一种组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)，已知可以抑制转录。一个可行的假设是，Rpd3 在酸性条件下抑制 E-pro 转录并稳定 rDNA。本财年，我们首次利用二维琼脂糖电泳证实酸性条件下DNA复制抑制序列的终止频率没有变化，并且非编码启动子（E-pro）的转录物量也没有变化。减少并由北方分析证实。我们还使用染色质免疫沉淀研究了 Rpd3 与 rDNA 结合和定位的酸度依赖性变化。由于冠状病毒的流行，出现了意想不到的问题，比如研究材料特别是PCR相关试剂的获取困难，我们在承接后终于能够进行染色质免疫沉淀方法。目前数据还不稳定，我们正在结合条件继续分析。

项目成果

DNA複製阻害時のDNA二本鎖切断修復によるrDNAコピー数制御機構の解明

DNA复制受到抑制时通过DNA双链断裂修复阐明rDNA拷贝数控制机制

• 发表时间: 2021
• 作者: Watanabe Kengo;Morishita Kazuhiro;Zhou Xiangyu;Shiizaki Shigeru;Uchiyama Yasuo;Koike Masato;Naguro Isao;Ichijo Hidenori;Yoshiyuki Fukuda;佐々木真理子
• 通讯作者: 佐々木真理子

寿命延長～老化・長寿命の基盤研究最前線～,

寿命延长：衰老与长寿基础研究前沿，

• 发表时间: 2022
• 作者: 堀 優太郎;小林 武彦
• 通讯作者: 小林 武彦

小林武彦研究室

小林武彦实验室

遺伝学の百科事典ー継承と多様性の源、日本遺伝学会編

遗传学百科全书：遗传和多样性的来源，日本遗传学会编辑

• 发表时间: 2022
• 作者: Inaba;K.;久野秀二;吉川雅英;日本遺伝学会
• 通讯作者: 日本遺伝学会

ゲノム修復から見るゲノム安定性のプロファイル

从基因组修复中看到的基因组稳定性概况

• 发表时间: 2021
• 作者: Takayanagi Saki;Watanabe Kengo;Maruyama Takeshi;Ogawa Motoyuki;Morishita Kazuhiro;Soga Mayumi;Hatta Tomohisa;Natsume Tohru;Hirano Tomoya;Kagechika Hiroyuki;Hattori Kazuki;Naguro Isao;Ichijo Hidenori;黒田 真也;飯田哲史
• 通讯作者: 飯田哲史