ニワトリDT40細胞を用いた非相同組換え機構の遺伝的解析

鸡DT40细胞非同源重组机制的遗传分析

基本信息

批准号：
12771409
负责人：
足立典隆
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

ニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて,非相同組換えへの関与が示唆される遺伝子の破壊株(ホモ変異株)をジーンターゲティング法により作製し,解析を行った.1.DNA ligase IV : DNA ligase IV遺伝子破壊株およびKu70遺伝子との二重破壊株の解析を引き続き行った.DNA ligase IVが,Kuに依存した非相同組換え(エンドジョイニング)の過程に必須の役割を果たしていることを明らかにした.また,これらの破壊株におけるランダムインテグレーションおよびジーンターゲティングの頻度を詳しく調べた.2.DNA ligase III:ヘテロ変異株を取得し、解析を行った.また,ホモ変異株の取得を試みるとともに,DNA ligaseIIIが細胞増殖に必須である可能性を考慮し,条件致死変異株作製を試みた.3.FEN-1:ホモ変異株を取得し,解析を行った.FEN-1はDNA複製に必須ではないが,塩基除去修復に必須であることを明らかにした.また,組換え,特にランダムインテグレーションにおけるFEN-1の役割についても調べた.さらに,DNAポリメラーゼβとの二重破壊株を作製するため,DNAポリメラーゼβ遺伝子をクローニング,導入ベクターを作製して破壊株の分離を試みた.4.DNAトポイソメラーゼ(トポ)IIα:ヘテロ変異株の解析を引き続き行った.マウスES細胞での結果と同様,ヘテロ変異株の増殖速度は野生株と変わらなかったが,VP-16やICRF-193等のトポII阻害剤に対する感受性が低下していた.また,組換え,特にランダムインテグレーションにおけるトポIIαの役割についても調べた.

使用鸡 B 淋巴样细胞系 DT40，创建了一种被认为参与非同源重组的基因破坏菌株（同源突变菌株），并使用基因靶向方法进行了分析 1. DNA 连接酶 IV：DNA 我们继续分析连接酶。 IV基因破坏菌株和Ku70基因双破坏菌株。DNA连接酶我们揭示了 IV 在 Ku 依赖性非同源重组（末端连接）过程中发挥着重要作用。我们还详细研究了这些破坏菌株中的随机整合和基因靶向频率。 2. DNA 连接酶 III：杂合子。获得并分析了突变株。此外，在试图获得纯合突变株时，考虑到连接酶III对于细胞增殖至关重要，我们尝试创建条件致死突变株。 3.FEN-1：获得并分析了纯合突变株FEN-1对于DNA复制不是必需的。对于碱基切除修复至关重要我们还研究了FEN-1在重组，特别是随机整合中的作用。此外，为了用DNA聚合酶β创建双破坏菌株，我们还研究了FEN-1在重组，特别是随机整合中的作用。我们克隆了该基因，创建了一个导入载体，并尝试分离出破坏的菌株。 4. DNA拓扑异构酶（topo）IIα：我们继续分析杂合突变菌株，与小鼠ES细胞的结果类似，杂合突变菌株的生长。率虽然敏感性与野生型菌株没有差异，但对拓扑II抑制剂如VP-16和ICRF-193的敏感性下降。我们还研究了拓扑IIα在重组，特别是随机整合中的作用。