DT40細胞を用いた非相同組換え機構の遺伝的解析

使用DT40细胞进行非同源重组机制的遗传分析

基本信息

批准号：
14771289
负责人：
足立典隆
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ニワトリBリンパ細胞株DT40を主材料に用いて,非相同組換えへの関与が示唆される遺伝子の破壊株(ホモ変異株)をジーンターゲティング法により作製し,解析を行った。1.DNA ligase IV:ホモ変異株においてランダムインテグレーション頻度が著しく低下していること,またジーンターゲティング効率が上昇していることがわかった。これらの表現型はKu変異株や二重変異株においても全く同様であった。またターゲティング効率の低い遺伝子座において特に上昇率が高かった。したがって,非相同組換え(エンドジョイニング)がランダムインテグレーションの主要機構であり,この反応を抑制することでジーンターゲティングを効率良く行える可能性が示された。一方以上の結果をもとに,ヒト細胞への応用を試みた。2.DNA ligase III:得られたヘテロ変異株を用いてホモ変異株の取得を試みた,必須遺伝子である可能性が高いため,テトラサイクリン制御系を利用した条件致死変異株の作製に着手した。3.FEN-1:ホモ変異株においてランダムインテグレーション頻度が上昇していることがわかった。これはFEN-1欠損によりゲノムが不安定になるためと考えられる。またDNAポリメラーゼβとの二重変異株の解析から,脱塩基部位の修復に関わる新規経路が存在する可能性が示唆された。4.DNAポリメラーゼβ:ホモ変異株においてランダムインテグレーション頻度が約半分に低下している可能性が示された。さらに詳細な解析を行う必要があるが,動物細胞のランダムインテグレーションに関わるDNAポリメラーゼはいまだ同定されていないため,非常に興味深い。5.DNAトポイソメラーゼII:ヘテロ変異株において抗癌剤エトポシドに対する感受性が約半分に低下していることを明らかにした。一方,DNA ligase IV変異株やKu変異株において,エトポシドに対する感受性が著しく増大していることを見い出した。DNA ligase IV変異株においてトポイソメラーゼIIをヘテロにしてもやはりエトポシド感受性は約半分に低下した。これらの結果はトポイソメラーゼII損傷修復においてエンドジョイニングが必須の役割を果たすことを示している。

我们以鸡B淋巴样细胞系DT40为主要材料，通过基因打靶创建了一个被认为参与非同源重组的基因破坏菌株（同质突变菌株）并对其进行了分析。 1、DNA连接酶IV：发现纯合突变体中随机整合频率显着降低，基因打靶效率提高。这些表型在Ku突变株和双突变株中完全相同。此外，在靶向效率低的位点，增加率特别高。因此，非同源重组（末端连接）是随机整合的主要机制，抑制这种反应表明有效基因靶向的可能性。基于以上结果，我们尝试将其应用于人体细胞。 2.DNA连接酶III：我们试图利用获得的杂合突变体来获得纯合突变体。由于该基因很可能是必需基因，因此我们开始使用四环素控制系统创建条件致死突变体。 3.FEN-1：发现纯合突变体中随机整合频率增加。这被认为是因为FEN-1缺陷导致基因组变得不稳定。此外，用 DNA 聚合酶 β 对双突变株进行的分析表明，可能存在一条参与脱碱基位点修复的新途径。 4. DNA聚合酶β：研究表明，纯合突变体中随机整合频率可能降低约一半。尽管还需要更详细的分析，但这非常有趣，因为动物细胞中参与随机整合的DNA聚合酶尚未被识别。 5、DNA拓扑异构酶II：杂合突变株对抗癌药物依托泊苷的敏感性降低了约一半。另一方面，我们发现DNA连接酶IV突变体和Ku突变体对依托泊苷的敏感性显着增加。即使当拓扑异构酶 II 在 DNA 连接酶 IV 突变体中杂合时，依托泊苷敏感性仍降低约一半。这些结果表明端接在拓扑异构酶 II 损伤修复中起着重要作用。