血流感染症における新規迅速診断法の開発と重症度判定の臨床的有用性の評価

开发一种新的血流感染快速诊断方法并评估其严重程度的临床实用性

基本信息

  • 批准号:
    22K15688
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.83万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
  • 财政年份:
    2022
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2022-04-01 至 2025-03-31
  • 项目状态:
    未结题

项目摘要

敗血症は、医療が発達した現代においても死亡率が30~50%と治療困難な病態であり、「早期診断と早期治療介入」が救命率を改善させる最も効果的な手段とされている。敗血症診断の臨床検査法として敗血症マーカーと血液培養検査の2つが用いられているが、早期診断と早期治療介入が重要な敗血症診断において現状の臨床検査法では不十分といえる。本研究は、第3世代PCRと呼ばれるデジタルPCR技術を用いて、敗血症診断の新たな臨床検査法の開発を目指すことを目的としている。デジタルPCRは微量な核酸検出や細菌の絶対定量が可能であり、本研究により培養前検体からの新たな細菌検出法の確立や血中細菌数を指標とした敗血症の重症度・治療効果判定への応用が期待される。本研究では、デジタルPCRでどの程度微量な核酸検出が可能となるのかが重要になってくる。基礎的検討として、まずTotal bacteria検出用FAM標識probe/primerを用いてデジタルPCRの検出限界を確かめた。初期の検討ではバックグラウンドの蛍光強度が強く(70copies/μL)、微量な核酸検出に干渉し大きな問題となったが、試薬調整や実験手技等の見直し、環境サンプル対応のマスターミックスを用いることでこの問題を解決した。次に、どの程度微量な核酸が検出できるかを、大腸菌ゲノムDNA 1ng, 0.1ng, 0.01ng, 0.001ngの4点で検討した。ネガティブコントロールでも1copies/μL程度はバックグラウンドとして検出されてしまうものの、大腸菌ゲノムDNAが 0.001ngと微量であっても3copies/μL程度検出され、ネガティブコントロールと明確に区別することができた。これらの検討結果から、最適なPCR条件の設定や検出可能な細菌数の把握という初年度の研究計画はおおむね達成できたといえる。
脓毒症是一种难以治疗的疾病,即使在医疗先进的现代,死亡率也高达30-50%,“早期诊断、早期治疗干预”被认为是提高生存率的最有效手段。脓毒症的诊断有两种临床检测方法:脓毒症标志物和血培养检测,但目前的临床检测方法不足以诊断脓毒症,早期诊断和早期治疗干预非常重要。本研究旨在开发一种新的临床测试方法,使用称为第三代 PCR 的数字 PCR 技术来诊断脓毒症。数字PCR能够检测微量核酸并对细菌进行绝对定量,这项研究将建立一种从预培养标本中检测细菌的新方法,并利用数字来确定脓毒症的严重程度和治疗效果。血液中的细菌作为指标的应用是值得期待的。在这项研究中,一个重要的问题是如何使用数字 PCR 检测少量核酸。作为一项基础研究,我们首先确认了使用 FAM 标记探针/引物检测总细菌的数字 PCR 的检测限。在最初的研究中,背景荧光强度很强(70拷贝/μL),这导致了一个主要问题,因为它干扰了痕量核酸的检测,但通过审查试剂制备和实验技术,并使用预混液与环境样品兼容的问题得到了解决。接下来,我们研究了如何使用四种大肠杆菌基因组 DNA 样本检测少量核酸:1 ng、0.1 ng、0.01 ng 和 0.001 ng。即使在阴性对照中,也检测到约 1 个拷贝/μL 作为背景,但即使使用 0.001 ng 的微量大肠杆菌基因组 DNA,也检测到约 3 个拷贝/μL,并且可以与阴性对照清楚地区分开。根据这些研究结果,可以说第一年的研究计划——设定最佳PCR条件和确定可检测细菌的数量已经基本实现。

项目成果

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