クリプトコックス感染におけるC型レクチン受容体の糖鎖認識機構の解明

阐明隐球菌感染中C型凝集素受体的碳水化合物识别机制

基本信息

批准号：
17H00637
负责人：
丹野大樹
金额：
$ 0.36万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H00637/
关键词：
クリプトコックス自然免疫 C型レクチン受容体

项目摘要

本研究は、世界エイズ死因第2位であるクリプトコックス感染症に着目し、近年注目を浴びているC型レクチン受容体との糖鎖認識機序を明らかにすることで自然免疫における真菌の感染認識機構を理解する目的で行われた。近年、東北大学医学系研究科の川上グループらは、クリプトコックス感染においてDectin-2がTh2サイトカインとムチンの産生に関わることを明らかにし(Nakamura et al. Infect. Immun. 2015)、クリプトコックスの認識にDectin-2が関与することが推測された。私はこれまでの検討により、クリプトコックスのDectin-2リガンドがクリプトコックス菌体表面ではなく細胞壁内にあることを突きとめ、そのリガンドがMannoseを含む構造体であることを明らかにした。本研究ではリガンドのより詳細な構造を解析するとともに、Dectin-2KOマウス由来の骨髄由来樹状細胞(BM-DCs)を用いてサイトカイン産生能を解析することでより生体に近い免疫応答を観察した。Dectin-2のプラスミドを発現した2B4-NFAT-GFP reporter cellを種々のサンプルで刺激しGFPの発現をフローサイトメーターで解析すると、クリプトコックス菌体のβグルカナーゼ処理上清中に強いGFP活性があることが確認された。さらに、糖を選択的に結合させるコンカナバリンA(ConA)を用いたアフィニティクロマトグラフィーでβグルカナーゼ処理上清内のConA結合画分を粗精製することで、ConA結合画分中にβグルカナーゼ処理上清よりも強いGFP活性が得られることが確認された。加えて、Dectin-2KOマウスから採取したBM-DCsとConA結合画分を24時間共培養し、培養上清中の炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIL-12p40)をELISA法により測定すると、Dectin-2KOマウスでは野生型マウスと比較しこれらサイトカインの産生が有意に低下することが確認された。本研究によりクリプトコックス内のDectin-2リガンドはConAに結合する糖を主成分とする構造であることが示唆された。粗精製されたConA結合画分は、Dectin-2を介してTh1関連サイトカインの産生を誘導することが明らかになり、Dectin-2がクリプトコックスの感染防御に関与することが示唆された。リガンドの正確な構造を明らかにするため、ConA結合画分を用いた糖鎖構造の詳細な解析が今後必要と考えられた。

这项研究重点关注全球第二大艾滋病死亡原因——隐球菌感染，旨在阐明近年来备受关注的C型凝集素受体的糖链识别机制。了解识别机制。最近，东北大学医学研究生院的 Kawakami 小组及其同事发现，Dectin-2 参与隐球菌感染中 Th2 细胞因子和粘蛋白的产生（Nakamura et al. Infect. Immun. 2015），并表明 Dectin-2参与隐球菌感染中Th2细胞因子和粘蛋白的产生（Nakamura等人推测Dectin-2参与其中。通过之前的研究，我发现隐球菌的Dectin-2配体位于细胞壁内，而不是在隐球菌细胞表面，并揭示该配体是含有甘露糖的结构。在本研究中，我们分析了配体的详细结构，并使用Dectin-2KO小鼠的骨髓源性树突状细胞（BM-DC）分析了细胞因子的产生能力，从而观察到更类似于活体的免疫反应.当用各种样品刺激表达Dectin-2质粒的2B4-NFAT-GFP报告细胞并使用流式细胞仪分析GFP表达时，在用β-葡聚糖酶处理的隐球菌细胞的上清液中发现了强GFP活性，这证实了这一点。此外，通过使用选择性结合糖的伴刀豆球蛋白A(ConA)的亲和层析粗纯化β-葡聚糖酶处理的上清液中的ConA结合级分，证实了β-葡聚糖酶处理的上清液获得了更强的GFP活性。。另外，将从Dectin-2KO小鼠采集的BM-DC与ConA结合级分共培养24小时，通过ELISA测定培养上清中的炎性细胞因子（TNF-α、IL-12p40），结果确认了Dectin与野生型小鼠相比，-2KO 小鼠中这些细胞因子的产生显着减少。这项研究表明，隐球菌中的 Dectin-2 配体具有一种结构，其主要成分是与 ConA 结合的糖。结果表明，粗纯化的 ConA 结合级分通过 Dectin-2 诱导 Th1 相关细胞因子的产生，表明 Dectin-2 参与防止隐球菌感染。为了阐明配体的确切结构，未来有必要使用ConA结合部分对糖链结构进行详细分析。