病原細菌の新規染色体複製システムの解明

阐明病原菌的新型染色体复制系统

基本信息

批准号：
24659195
负责人：
清水徹
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24659195/
关键词：
ウェルシュ菌染色体複製ガス壊疽増殖速度細菌

项目摘要

24年度はDNAマイクロアレイを用いた複製中の染色体DNAの定量を行なった。ウェルシュ菌strain 13をGAM培地中にて37°Cで培養を行い、増殖の活発な対数増殖期の染色体DNAを調製し、さらにコントロールとして静止期のDNAを調製した。両DNAを鋳型としCy5 、Cy3でラベルしたcDNAを合成し、ウェルシュ菌DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせ、本菌の全遺伝子領域ごとの両増殖時期のDNA量を定量し静止期を分母とした対数増殖期のDNA量を計算した。その結果、対数増殖期の複製開始点 (ori) のDNA量は複製終止点 (ter) よりも2倍程度多く、基本的なori-ter型の複製が進んでいることが示されたが、oriからterに至る途中の領域にもDNA量が多い部分、つまり部分的にDNA複製が起きている可能性のある領域が複数確認された。これらの染色体複製部位を詳細に解析するため、対数増殖期~静止期における時間ごとの変化を解析した。これらの複製部位におけるDNA量は初期では複数の複製開始ピークが見られたが、時間とともにその数と大きさが減少し通常の複製パターンを示していくことが判明した。培養温度を30°C に変化させ増殖速度を抑制すると、通常のori-ter型の複製パターンしか見られなかったことから、複数の複製開始ピークは増殖速度が速い時に現れる現象であることが推察された。さらに独立した実験として、ウェルシュ菌DNA断片をクロラムフェニコール耐性遺伝子に結合させて遺伝子ライブラリーを作成し、ウェルシュ菌に形質転換したところ、本来はDNAを複製できずに耐性菌の生育が見られないはずのところ、多数の菌が生育した。このことはこれらの菌内にあるDNAにDNA複製開始部位が含まれることを示唆しており、ウェルシュ菌DNAには自己複製部位が多数存在することが強く考えられた。

2012 年，我们使用 DNA 微阵列对复制的染色体 DNA 进行了定量。将产气荚膜梭菌菌株13在37℃的GAM培养基中培养，制备活跃生长对数期的染色体DNA，和稳定期DNA作为对照。以两种DNA为模板合成Cy5和Cy3标记的cDNA，与产气荚膜梭菌DNA微阵列杂交，对该细菌的每个基因区域在两个生长时期的DNA量进行定量，并以稳定期作为分母进行对数生长。计算每个阶段的DNA量。结果显示，对数生长期复制起点（ori）处的DNA量约为复制终止点（ter）处的DNA量的两倍，表明基础ori-ter复制正在进行多个大面积区域。在 ori 和 ter 之间的区域也发现了大量 DNA，该区域可能发生了部分 DNA 复制。为了详细分析这些染色体复制位点，我们分析了从对数生长期到稳定期随时间的变化。研究发现，这些复制位点的DNA量在早期表现出多个复制起始峰，但这些峰的数量和大小随着时间的推移而减少，并表现出正常的复制模式。当将培养温度改变为30°C以抑制生长速率时，仅观察到正常的ori-ter型复制模式，表明多个复制起始峰是在生长速率高时出现的现象。此外，在一项独立实验中，我们通过将产气荚膜梭菌DNA片段与氯霉素抗性基因连接起来创建了基因库，并转化了产气荚膜梭菌，发现抗性细菌在生长，尽管它们无法大量复制DNA。细菌在不该生长的地方生长。这表明这些细菌内的DNA含有DNA复制起始位点，并且强烈表明产气荚膜梭菌DNA含有许多自我复制位点。