Muliple nicks-induced interhomolog recombination

多个切口诱导的同源间重组

基本信息

批准号：
22H03741
负责人：
中田慎一郎
金额：
$ 10.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

DNA2本鎖切断（DSB）の修復経路の一つとして相同組み換えがある。多くの場合、姉妹染色分体を鋳型とした正確なDNA修復が行われる。相同染色体を鋳型とする修復が起こる場合には、ヘテロ接合性が喪失する危険がある。しかし、頻度が極めて低いため、これまで重視されなかった。最近、申請者らは、両方の相同染色体にDNA1本鎖切断（SSB）であるニックが発生した場合、DSB発生時を大きく上回る頻度で相同染色体間組換え（IHR）が発生することを発見した。Cas9D10AとsgRNAを用いてゲノム上に部位特異的なニックを発生させることでIHRを誘導した。既知のDNA修復に関与する遺伝子のノックアウト、ノックダウン細胞において、ニック誘導型IHR（N-IHR）の効率を測定した。N-IHRにどの既知遺伝子がどの程度関与するのか明らかとなってきた。一方で、DSBのHRには必須にもかかわらず、N-IHR効率に全く影響を及ぼさない遺伝子も存在する。N-IHRでは、遺伝子変異やシングルヌクレオチドポリモルフィズム（SNP）を利用して、アレル特異的なニック（野生型配列にはニックを発生させない）を発生させると、変異およびSNPは野生型に変換される。この特徴を生かし、多様な遺伝子において、N-IHRの誘導を実施している。Cas9-ガイドRNAの標的特異性は、すなわちオフターゲット認識をしやすいかどうかと同義である。しかし、遺伝子変異・SNP配列がCas9D10AsgRNAの標的となり、対立遺伝子上の配列はオフターゲット認識がされにくくなるようにガイドRNAをデザインしても、遺伝子変異・SNP配列に対する特異性が示されない場合が多く存在することが明らかとなってきている。

同源重组是双链DNA断裂（DSB）的修复途径之一。在许多情况下，使用姐妹染色单体作为模板进行精确的DNA修复。如果将同源染色体作为模板进行维修，则存在杂合性损失的风险。但是，由于它极低，因此直到现在还没有强调它。最近，申请人发现，当两种同源染色体具有单链DNA断裂（SSB）时，同源的染色体体重组（IHR）的发生频率大于在DSB发育中明显大的频率。 IHR是通过使用CAS9D10A和SGRNA在基因组上产生特定位点特异性刻痕来诱导的。在已知的DNA修复基因的基因敲除和敲除细胞中测量了镍诱导的IHR（N-IHR）的效率。已经很清楚哪些已知基因参与N-IHR以及它们的参与程度。另一方面，尽管对于DSB中的HR至关重要，但也有根本不影响N-IHR效率的基因。在N-IHR中，当遗传突变和单核苷酸多态性（SNP）被用来产生等位基因特异性刻痕（野生型序列不发nicke）时，突变和SNP被转换为野生型。利用这种特征，在多种基因中进行了N-IHR诱导。 CAS9指南RNA的目标特异性与它是否容易脱离目标识别是同义词。但是，很明显，即使基因突变/SNP序列成为cas9d10asgrna的靶标，并且等位基因序列的设计目的是使难以识别靶向靶向，在许多情况下，在许多情况下未显示基因突变/SNP序列的特异性。