ウェルシュ菌における病原因子のグローバル制御機構の解析

产气荚膜梭菌毒力因子整体调控机制分析

基本信息

批准号：
06770194
负责人：
清水徹
金额：
$ 0.58万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770194/
关键词：
C.pertringens 遺伝子発現調節三成分制御系

项目摘要

申請時に提出した計画書の通りに実験を行ない、以下の結果を得たので報告する。1.ウェルシュ菌染色体ライブラリーの作製シャトルベクターpJIR418のHindIII切断部位へ、ウェルシュ菌strain13の染色体をHindIIIに部分分解した3-7kbの断片を挿入し、大腸菌へ形質転換して染色体ライブラリーを作製した。得られた大腸菌コロニーを集菌し、プラスミドDNAを大量調整して以下の実験に用いた。ライブラリーより96穴マイクロタイタ-プレートを用いてプラスミドを計1,200個調製し、フィルターメンブラン上へそれぞれをブロットして変性後、スクリーニングに用いた。2.ウェルシュ菌virR遺伝子により転写レベルで調節される遺伝子群の同定ウェルシュ菌strain 13とそのvirR遺伝子変異株TS133株より全RNAを調製し、それぞれをrandom primer、[α-^<32>P]dCTR、AMV reverse transcriptaseを用いてラベルした。前述のライブラリーをブロットしたフィルターに対してこれらのプローブをハイブリダイゼーションし、strain13とTS133のプローブでハイブリダイズした放射活性を比較し、明らかに活性の異なるクローンを選択した。計15個のクローンが選択され、そのうちstrain13の方が強いものが9個、TS133の方が強いものが6個であった。このことは、得られたクローンのうち9個がvirRによって正に調節され、残りの6個は負に調節される遺伝子を含んでいる可能性を示している。これらのクローンのプラスミドDNAを調べたところ、全て異なる長さのDNA断片を含んでおり、virRによって調節される複数の遺伝子群がクローニングされたと思われる。今後、これらのクローンについてさらなる解析を行っていきたい。

我们按照申请时提交的计划进行了实验，并报告了以下结果。 1.产气荚膜梭菌染色体文库的制备将产气荚膜梭菌菌株13的染色体部分消化到HindIII中获得的3-7kb片段插入穿梭载体pJIR418的HindIII切割位点，并转化到大肠杆菌中以制备染色体文库。收集所得的大肠杆菌菌落，并大量制备质粒DNA并用于以下实验。使用 96 孔微量滴定板从文库中制备了总共 1,200 个质粒，将每个质粒印迹到滤膜上、变性并用于筛选。 2.产气荚膜梭菌virR基因在转录水平调控基因的鉴定从产气荚膜梭菌菌株13及其virR基因突变菌株TS133制备总RNA，每个RNA均使用随机引物，[α-^ 32>P]使用 dCTR 和 AMV 逆转录酶进行标记。将这些探针与印有上述文库的滤膜杂交，比较与strain13和TS133探针杂交的放射性，选择活性明显不同的克隆。总共选择了15个克隆，其中9个在菌株13中较强，6个在TS133中较强。这表明获得的克隆中有9个可能含有受virR正向调节的基因，其余6个可能含有负向调节的基因。对这些克隆的质粒DNA的检查显示，它们都含有不同长度的DNA片段，表明克隆了多个受virR调控的基因组。未来，我们希望对这些克隆进行进一步的分析。