In vivo genome editing using hepatocyte-targeted RNA delivery system

使用肝细胞靶向 RNA 递送系统进行体内基因组编辑

基本信息

批准号：
19F19116
负责人：
片岡一則
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kawasaki Institute of Industrial Promotion Innovation Center of NanoMedicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19F19116/
关键词：
RNA医薬ゲノム編集高分子ミセル CRISPR/Cas9

项目摘要

本研究では、Cas9 mRNAとガイドRNAを用いたCRISPR/Cas9生体内導入による肝臓でのゲノム編集を目指し、RNA送達のための高分子ミセル開発に取り組んだ。その際、(1)生体内でのRNA酵素分解の抑制、(2)鎖長の大きく異なるCas9 mRNAとガイドRNAの共送達法の確立、(3)肝細胞指向性の付与が課題となった。前年度、(1)を達成し、(2)についてin vitroで基礎的な知見を得ていたため、本年度は(2)のin vivo試験と(3)に取り組んだ。(2)について、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを開発したところ、それぞれを単独で搭載したミセルを混合して投与した場合と比べ、優れた生体内ゲノム編集活性を示めした。物理化学的メカニズム解析の結果、共搭載により短鎖RNAがより安定にミセル内に保持されることが明らかとなった。(3)について、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドであるトリアンテナNアセチルガラクトサミンをミセル表面に搭載することで、静脈内投与後のミセルの肝集積性が10倍以上向上した。in vivo共焦点顕微鏡を用いた生きたマウスの肝臓のリアルタイム観察により、ミセルの類洞内皮細胞トランスサイトーシスによる能動的な肝実質への移行が示唆された。さらに、このリガンドを表面に修飾し、Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルをマウスに投与したところ、肝実質細胞において、効率的なゲノム編集が観察された。このように当初の計画内容を実現した。また、当初の計画を超えて、脳へのゲノム編集にも取り組んだ。Cas9 mRNAとガイドRNAを共搭載したミセルを用いることで、神経細胞、アストロサイト、ミクログリアにゲノム編集活性を得ることができた。RNAを用いて脳実質でのゲノム編集を実現した世界で初めての報告である。

在这项研究中，我们的目标是通过使用Cas9 mRNA和引导RNA在体内引入CRISPR/Cas9来编辑肝脏中的基因组，并致力于开发用于RNA递送的聚合物胶束。当时的挑战是（1）抑制体内RNA酶促降解，（2）建立链长度显着不同的Cas9 mRNA和指导RNA的共同递送方法，以及（3）赋予肝细胞趋向性。去年，我们实现了（1）并获得了（2）体外测试的基础知识，因此今年我们致力于（2）体内测试和（3）。关于（2），当我们开发共同负载Cas9 mRNA和指导RNA的胶束时，与单独施用负载每种的胶束混合物相比，它们表现出优异的体内基因组编辑活性。物理化学机制分析的结果表明，通过共负载，短链RNA可以更稳定地保留在胶束内。关于(3)，通过将肝细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体的配体三触角N-乙酰半乳糖胺负载到胶束表面，静脉内给药后胶束的肝脏蓄积提高了10倍以上。使用体内共聚焦显微镜对活体小鼠肝脏的实时观察表明，胶束通过窦内皮细胞转胞吞作用主动迁移到肝实质中。此外，当将表面修饰有该配体并共同装载 Cas9 mRNA 和向导 RNA 的胶束给予小鼠时，在肝实质细胞中观察到有效的基因组编辑。这样，原计划就实现了。他们还超出了最初的计划，致力于大脑基因组编辑。通过使用共同装载 Cas9 mRNA 和向导 RNA 的胶束，我们能够在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中获得基因组编辑活性。这是世界上第一份使用 RNA 对脑实质进行基因组编辑的报告。