Pathologic analysis of age-related diseases based on individual quantification of polyubiquitin chain forms

基于多聚泛素链形式个体定量的年龄相关疾病的病理分析

基本信息

批准号：
19K07899
负责人：
高田耕司
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ユビキチン－プロテアソーム系やオートファジー系が担う不要なタンパク質の合目的分解は、真核生物の細胞内タンパク質の恒常性（プロテオスタシス）の維持に不可欠である。近年、老化に伴って、両分解系の機能が低下し、加齢性疾患の発症リスクとなる可能性が多数報告されている。そこで本研究では、両系の分解シグナルであるポリユビキチン鎖に着目し、プロテオスタシスに基づく老化マーカーとしての意義を検討する。ポリユビキチン鎖を認識するFK2抗体を固相と検出に用いたFK2-FK2 sandwich ELISAは、3種類（K48鎖，K64鎖，M1鎖）の各ポリユビキチン長鎖を区別なく検出し、測定値は全鎖総量に対応することが明確となった。各鎖型に特異的な測定系を確立するため、市販の各鎖（K48鎖，K64鎖，M1鎖）特異抗体を検出に用いた様々なFK2-各抗体 sandwich ELISAを検証したが、どの組み合わせも実用レベルの感度や特異性を示さなかった。ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1を用いた検討では、細胞集団倍加数（PDL）62を超えると同細胞の倍加速度が遅延し、その後、肥大扁平化やSA-β-galの発現などの複製老化の特徴を示したため、PDL 24～34群、43～56群、62～72群の細胞から、1% Triton X-100可溶化画分とその不溶成分を2% SDSで可溶化した画分を調製し、分画ごとに各群のポリユビキチン鎖量を比較した。しかし、予想に反して、各平均値に有意差はなく、細胞老化の影響を見出せなかった。TIG-1細胞の老化とプロテアソーム活性の関係についても同様の結果を得ているが、実験手法の見直しなどの再検証を予定している。

泛素 - 蛋白酶体和自噬系统实现不必要的蛋白质的有目的降解对于维持真核细胞内蛋白的稳态至关重要。近年来，有许多报道称，由于衰老，两种降解系统的功能都在下降，导致患有与年龄相关的疾病的风险。因此，在这项研究中，我们专注于两种系统的降解信号的多泛素链，并基于蛋白质的衰老标记物的意义。很明显，FK2-FK2三明治ELISA使用FK2抗体，该抗体可以识别多泛素链进行检测和固相，检测了三种类型的多泛素长链（K48链，K64链和M1链），而无需区分的值对应于总链链的总量。为了建立针对每种链类型的测量系统，使用市售链（K48，K64，M1）进行检测的特定抗体测试了各种基于FK2的三明治ELISA，但没有任何组合显示实用的敏感性或特异性。在使用TIG-1的研究中，当细胞群数量倍增数（PDL）超过62时，同一细胞的加倍速率被延迟，随后，显示了复制性衰老的特征，例如肥大平坦和SA-β-GAL表达。因此，将1％Triton X-100溶解化的部分及其不溶性组分与来自PDL组的2％SDS溶解，并比较每组中的PDL组24-34、43-56和62-72细胞。但是，与预期相反，每个平均值没有显着差异，并且没有发现细胞衰老的影响。关于Tig-1细胞衰老与蛋白酶体活性之间的关系，也获得了类似的结果，但我们计划重新检查实验方法等。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

動物細胞におけるポリユビキチン鎖量の変動と基準値

动物细胞中多聚泛素链含量的变化及参考价值

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Osada K;Miyazono S;Noguchi T;Kashiwayanagi M;小針佑介，平河多恵，加藤尚志，髙田耕司
通讯作者：
小針佑介，平河多恵，加藤尚志，髙田耕司

線維芽細胞の老化とポリユビキチン鎖の量との関係について．

关于成纤维细胞衰老与多聚泛素链数量的关系。

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sato K;Yoshizawa H;Seki T;Shirai R;Yamashita T;Okano T;Shibata K;Wakamatsu MJ;Mori Y;Morita T;Matsuyama TA;Ishibashi-Ueda H;Hirano T;Watanabe T.;小針佑介，平河多恵，加藤尚志，高田耕司
通讯作者：
小針佑介，平河多恵，加藤尚志，高田耕司

ポリユビキチン量を指標とした化学物質の細胞毒性評価

以多聚泛素含量为指标评价化学物质的细胞毒性