白血病細胞の分化と病型に特徴的なユビキチン化蛋白質の解析

白血病细胞分化和疾病类型特征的泛素化蛋白分析

基本信息

批准号：
09267235
负责人：
高田耕司
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度の成果は以下の3点である。1.マルチユビキチン化蛋白質の生成速度の解析白血病細胞の分化が細胞内蛋白質のユビキチン化に与える影響を解析するため、対数増殖期および酪酸等で分化したK562細胞におけるマルチユビキチン鎖生成速度を求めた。その際、プロテアソーム阻害剤でマルチユビキチン化蛋白質の分解を抑え、その濃度の経時的変化を特異的ELISAで追跡した。結果、分化に伴い『細胞質の水溶性蛋白質』に対する同速度は有意に増加し、『細胞質と核の難溶性蛋白質』に対する同速度は激減した。また、対数増殖期の場合、後者の速度は熱ショックによって増加するが、分化に伴いこの性質も消失した。以上の結果から、ユビキチン化される主要な蛋白質群が分化と共に大きく変わると推定される。今後、分化や増殖に特徴的なマルチユビキチン化蛋白質を精製し、標的蛋白質を同定することで、その生物学的意義を明確にする。2.マルチユビキチン化蛋白質の精製の検討結合型ユビキチンに特異的なモノクローナル抗体FK2をアガロースゲルに導入しアフィニティーカラムを作成した。K562細胞抽出液(>10mg protein)のマルチユビキチン化蛋白質は、同カラム(1ml)にほぼ完全に吸着し、大半の夾雑蛋白質から分離された。また、これを3.5 M MgCl_2で溶出した画分には、常に元の40-50%のマルチユビキチン鎖が回収された。今後、精製標品から標的蛋白質を含む断片を得るための条件設定を進める。3.OCI/AML la細胞のユビキチン抗体陽性蛋白質急性骨髄性白血病の患者細胞とOCI/AML-la細胞の核分画から、9kDaと13kDaのユビキチン抗体陽性蛋白質を見出した。他の株化白血病細胞(HL-60、K562等)における両蛋白質の量は極めて少なかった。大量のOCI/AML-la細胞から抽出・精製を進める計画である。

今年的结果如下：1。分析多泛素化蛋白的生产速率，分析白血病细胞分化对细胞内蛋白的泛素化的分化的影响，在对数生长酸和y酸等期间K562细胞中多拜素链的生产速率。目前，蛋白酶体抑制剂抑制了多泛素化蛋白的降解，随着时间的推移，浓度随着时间的推移而变化。结果，“细胞质水溶性蛋白”的速率随着分化而显着增加，“细胞质和核和核的速率较差，可溶性蛋白质差”会显着降低。此外，在对数阶段，由于热休克而后一个速率增加，但该特性也随着分化而消失。从以上结果来看，据估计，主要的泛素化蛋白质基团会随着分化而发生巨大变化。将来，将纯化分化和增殖的特征的多泛素化蛋白，并可以鉴定靶蛋白以阐明其生物学意义。 2。将多泛素化蛋白A单克隆抗体FK2的纯化（针对结合的泛素特异性）引入到琼脂糖凝胶中，以制备亲和力柱。 K562细胞提取物（> 10 mg蛋白）的多泛素化蛋白几乎完全吸附在同一色谱柱上（1 mL），并与大多数污染的蛋白质分离。此外，原始的40-50％多泛素链始终以3.5 m MGCL_2洗脱的分数恢复。将来，将设置获取含有纯化制剂的靶蛋白片段的条件。 3。OCI/AML LA细胞的泛素抗体阳性蛋白，我们发现9 kDa和13 kDa的泛素抗体阳性蛋白来自患者用急性髓样白血病和OCI/AML-LA细胞的患者细胞的核分数。其他白血病细胞（HL-60，K562等）中两种蛋白质的量非常小。该计划是从大量OCI/AML-LA细胞中进行提取和纯化。