オートファジー抑制因子Rubiconとその阻害剤の機能発現機構の解明

阐明自噬抑制因子 Rubicon 及其抑制剂的功能表达机制

• 批准号: 20K05839
• 负责人: 上西 達也
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K05839/
• 关键词: オートファジー; Rubicon; 化合物アレイ; タンパク質間相互作用; 阻害剤; タンパク質複合体; 構造解析; 薬剤開発; X線結晶構造解析; クライオ電子顕微鏡法; 肝障害; 寿命延伸

昨年度は、Rubiconのドメイン欠損変異体をヒト培養細胞に一過性に発現させ、その破砕液を化合物が架橋されたセファロースビーズと混合することで、化合物との相互作用にはRubiconのC末端側の一部の領域が重要であるという示唆を得た。そこで今年度はその再現を試みたものの、遊離の化合物の存在下でこの相互作用が競合的に阻害されず、むしろビーズと共沈するRubiconの量が増加したことから、Rubiconはビーズに架橋された化合物と相互作用していたというよりも、変性して沈殿していた可能性が高まった。なお、当初のスクリーニングにおいても両者の直接の結合の検出は行われていなかったため、新たに理研の長田研究室および東大の濡木研究室との共同研究で、Rubicon発現細胞の破砕液ではなく高度に精製されたRubiconを用いて、直接的な結合能を有する化合物のスクリーニングを開始している。一方、既報通りに実際にRubiconとの相互作用が確認できた14-3-3タンパク質およびNEMO以外にも、インタラクトーム解析から得られた複数の候補因子について共免疫沈降法によりRubiconとの相互作用の有無を引き続き調べた。リボソームタンパク質であるRPS17およびRPS27LはRubiconとは共沈しなかった。一方、昨年度に見出していた新規相互作用因子であるCa2+結合膜タンパク質との共沈に必要なRubiconのドメインを探索したところ、C末端の比較的広い領域が必須であることが判明した。さらにCa2+結合膜タンパク質についても同様に絞り込みを行ったところ、細胞質領域のC末端ドメインがRubiconとの相互作用に重要であることが示唆された。また、蛍光顕微鏡や近接ライゲーションアッセイにより、両者が細胞内で共局在することも確認している。

去年，我们在人类培养细胞中瞬时表达了 Rubicon 的结构域缺失突变体，并将破坏的溶液与化合物交联的琼脂糖珠混合，我们得到了该领域某些领域很重要的建议。因此，我们今年试图重现这种效应，但发现在游离化合物存在的情况下，这种相互作用并没有被竞争性抑制，而是与珠子共沉淀的 Rubicon 量增加，表明 Rubicon 没有与珠子交联。这增加了颗粒变性和沉淀的可能性，而不是与其他化合物相互作用。此外，由于在最初的筛选中没有检测到两者之间的直接结合，因此与RIKEN的Nagata实验室和东京大学的Nureki实验室进行了新的联合研究，使用高度浓缩的纯化Rubicon，我们已经开始筛选具有直接结合作用的化合物。结合能力。另一方面，除了之前报道的实际上被证实与 Rubicon 相互作用的 14-3-3 蛋白和 NEMO 之外，我们还通过免疫共沉淀研究了从相互作用组分析中获得的多个候选因子与 Rubicon 的相互作用。调查是否存在核糖体蛋白 RPS17 和 RPS27L 不与 Rubicon 共沉淀。另一方面，当我们寻找与Ca2+结合膜蛋白（去年发现的一种新型相互作用因子）共沉淀所需的Rubicon结构域时，我们发现相对较宽的C端区域是必不可少的。此外，当我们以同样的方式缩小Ca2+结合膜蛋白的范围时，表明细胞质区域的C末端结构域对于与Rubicon的相互作用很重要。此外，我们通过荧光显微镜和邻近连接测定证实两者在细胞内共定位。

项目成果

Molecular bandages: inside-out, outside-in repair of cellular membranes. Focus on "Myoferlin is critical for endocytosis in endothelial cells".

• DOI: 10.1152/ajpcell.00288.2009
• 发表时间: 2009-07-08
• 期刊: American journal of physiology. Cell physiology
• 作者: S. Cipta;H. Patel
• 通讯作者: H. Patel

Rubicon may regulate autophagy through Ca2+ with myoferlin

Rubicon 可能通过 Ca2+ 和肌成蛋白调节自噬

• 发表时间: 2022
• 作者: Fangze Duan; Keisuke Tabata; Ryosuke Kawagoe; Tatsuya Kaminishi; Shuhei Nakamura; Maho Hamasaki; Tamotsu Yoshimori
• 通讯作者: Tamotsu Yoshimori