Cryo-EMを用いる生体環境におけるβ2ミクログロブリン線維形成機構の解明

使用 Cryo-EM 阐明生物环境中 β2 微球蛋白原纤维形成机制

• 批准号: 20J10085
• 负责人: 張 春明
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University (2021)Osaka University (2020)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J10085/
• 关键词: 膜蛋白質複合体; 発現・精製; Cryo-EM; 単粒子構造解析; 破傷風毒素; グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素; 結晶構造解析; 溶液構造解析; 低温電子顕微鏡法解析

これまでに、私はミトコンドリアと小胞体の膜接触サイト(ERMES)複合体のCryo-EM構造解析を研究活動の中心に据え、チャレンジしてきた。先ず、構築できた高発現株を用いて、ERMES複合体の大量培養・高純度でのアフィニティ精製に成功した。収量は約7 mg/ml、100 μlだった。次に、精製できた複合体を用いて、Cryo-EM グリッドを作成し、Talos Arctica（東大・吉川研）で界面活性剤 (Digitonin と GDN)、サンプル濃度 (5～20 mg/mL)とグリッド (Au and Cu/Rh)の検討を行った。グリッドをスクリーニングした結果、低濃度より高濃度、Cu/RhよりAu、DigitoninよりGDNの方が単分散性と角分布のよい粒子（ミセル-蛋白質複合体）が観察された。そして、Krios G3i_Serial EM を用いて、ERMES複合体の電顕画像を収集し、所属研究室に導入・整備されているCryo-EM workstation を用いて、Relionなどの解析ツールで、単粒子構造解析を行った。また、ERMESの構成サブユニットであるMmm1の膜貫通（TM）領域で小胞体膜に結合，Mmm2-Mdm10によりミトコンドリア膜に結合しているので、Mmm1のTM領域をプロテアーゼで切り除くことによって、ERMES複合体の可溶性が高まり凝集が抑えられる、ナノディスクなどへの再構成が容易になることが期待できるため、(TMΔ-Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]或いは(GFP_TM-3C_Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]株の構築・発現を検討している。

迄今为止，我已经接受了专注于线粒体-内质网膜接触位点 (ERMES) 复合物的冷冻电镜结构分析的挑战。首先，我们使用构建的高表达菌株成功地大规模培养和高纯度亲和纯化ERMES复合物。产量约为 7 mg/ml，100 μl。接下来，使用纯化的复合物创建冷冻电镜网格，并使用 Talos Arctica（东京大学吉川实验室）制备表面活性剂（洋地黄皂苷和 GDN）、样品浓度（5-20​​ mg/mL）和网格。对金和铜/铑）进行了研究。网格筛选的结果是，观察到高浓度时比低浓度时、Au 比 Cu/Rh 和 GDN 比洋地黄皂苷具有更好的单分散性和角分布的颗粒（胶束-蛋白质复合物）。然后，我们使用 Krios G3i_Serial EM 收集了 ERMES 复合物的电子显微镜图像，并使用我们实验室安装和维护的 Cryo-EM 工作站，使用 Relion 等分析工具进行单颗粒结构分析。此外，ERMES的组成亚基Mmm1通过其跨膜（TM）区域与内质网膜结合，并通过Mmm2-Mdm10与线粒体膜结合，因此通过用蛋白酶去除Mmm1的TM区域，ERMES预计复合物的溶解度会增加，聚集会受到抑制，更容易重构成纳米圆盘等（TMΔ-Mmm1-3xFlag， Mmm2-10xHis、Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep、Mdm12、Vps39Δ)] 或 (GFP_TM-3C_Mmm1-3xFlag、Mmm2-10xHis、Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep、Mdm12、我们目前正在研究 Vps39Δ) 菌株的构建和表达。

项目成果

Structural flexibility of the tetanus neurotoxin revealed by crystallographic and solution scattering analyses

晶体学和溶液散射分析揭示破伤风神经毒素的结构灵活性

• DOI: 10.1016/j.yjsbx.2021.100045
• 发表时间: 2021
• 作者: Zhang Chun;Imoto Yoshihiro;Hikima Takaaki;Inoue Tsuyoshi
• 通讯作者: Inoue Tsuyoshi

Structural flexibility of the tetanus neurotoxin revealed by crystallographic and solution scattering analyses

晶体学和溶液散射分析揭示破伤风神经毒素的结构灵活性

• DOI: 10.1016/j.yjsbx.2021.100045
• 发表时间: 2021
• 作者: Zhang CM;Imoto Y;Hikima T;Inoue T
• 通讯作者: Inoue T