産業微生物の転写因子研究の分子レベルアプローチ

研究工业微生物转录因子的分子水平方法

基本信息

批准号：
20K05802
负责人：
日高將文
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

微生物は生育環境中の栄養源、ストレス源などの濃度変化を感知し、増殖や生存のため遺伝子・タンパク質の発現量を増減させる。そのメカニズムを追求していくと、どのタンパク質が関与しているのか？については分かってくる。では、それらのタンパク質はどのように物質濃度を感知しているのか？その感知した情報をどのように発現レベルにつなげているか？発現制御の分子メカニズムは、いわばブラックボックスとなっているものが多く、微生物の応用を妨げる一因ともなっている。このブラックボックスの解明には、タンパク質分子レベルの研究が不可欠である。本研究は、これまでの微生物学を含む農学研究であまり用いられることがなかった放射光の測定技術を積極的に導入し、分子レベルの微生物の発現制御メカニズム解明にアプローチする。そのための研究ターゲットとして、麹菌の4種の転写因子、AmyR、MalR、CreA、FlbCを選び、機能解析、構造解析を目指す。2022年度はFlbCについて、機能解析、構造解析を目指して大腸菌による発現系の構築を試みた。大腸菌で発現したFlbCは1リットル培養当たり1ミリグラムに満たず、結晶構造解析に供するためには不十分であった。発現条件、精製条件を検討し、特に培地条件を精密化することで、大腸菌1リットル培養当たり5ミリグラムのタンパク質獲得に成功した。精製FlbCはゲルシフト電気泳動解析により、DNAに結合する機能を有していることが確認された。結晶化スクリーニングによって、ポリエチレングリコールを沈殿剤とした結晶を獲得することができており、今後、放射光を利用したX線回折データ測定に供する予定である。

微生物感知其生长环境中营养物质浓度、应激源等的变化，并增加或减少基因和蛋白质的表达水平，以生长和生存。当我们探究该机制时，涉及哪些蛋白质？我会理解的。那么，这些蛋白质是如何感知物质浓度的呢？如何将感知到的信息与表达水平联系起来？很多控制表达的分子机制都是黑匣子，这也是阻碍微生物应用的原因之一。为了阐明这个黑匣子，蛋白质分子水平的研究至关重要。本研究将积极引入同步辐射测量技术，该技术在包括微生物学在内的农业研究中尚未得到广泛应用，以在分子水平上阐明控制微生物表达的机制。为此，我们将选择米曲霉AmyR、MalR、CreA和FlbC这四种转录因子，并对其功能和结构进行分析。 2022年，我们尝试使用大肠杆菌构建表达系统，目的是对FlbC进行功能和结构分析。大肠杆菌中表达的 FlbC 低于每升培养物 1 毫克，不足以进行晶体结构分析。通过检查表达和纯化条件，特别是改进培养基条件，他们成功地在每升大肠杆菌培养物中获得了 5 毫克蛋白质。通过凝胶位移电泳分析证实纯化的 FlbC 具有与 DNA 结合的能力。通过结晶筛选，我们能够获得使用聚乙二醇作为沉淀剂的晶体，我们计划将其用于使用同步加速器辐射的X射线衍射数据测量。