ATP7ファミリーの機能・構造解析

ATP7家族的功能和结构分析

• 批准号: 20J13299
• 负责人: 富田 篤弘
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J13299/
• 关键词: ATPase; タンパク質精製; タンパク質発現; 構造解析; 生物物理; 構造生物学; P型ATPase

本研究ではATP7 ファミリーと ATOX1 との複合体の構造を決定することで ATP7 ファミリーに対する ATOX1 からの銅イオンの受け渡し機構を明らかにし、ATP7 ファミリーの構造を銅イオン存在下で輸送過程の複数の状態で決定し、得られた構造をもとに 脂質と水分子を含む生体内の条件を再現した全原子分子動力学シミュレーション (MD シミュレーション を行うことで銅イオンの輸送経路・輸送機構を明らかにすることを目標とする。ATP7 ファミリーの構造決定に先駆けて、発現方法・精製方法の検討およびグリッド作成方法の検討を行った。その結果、ヒト由来の ATP7A/7B について構造決定に十分な純度・収量での精製方法の確立に成功し、クライオ電子顕微鏡での構造決定に向けたグリッドの調整方法の確立に成功した。しかしながら、調整したグリッドからは構造決定に十分な二次元投影像および二次元平均像を得ることはできなかった。原因としては、試料の均一性が 不十分であった点・精製試料の一部が凝集して二次元構造を維持していなかった点が挙げられる。これらの問題を解決するために、今後はタンパク試料の発現・精製方法の改善及びグリッド作成方法の最適化を行った。具体的には、凝集体を形成しているタンパク質の量を減らすために発現・精製方法の改善を行う。具体的には発現ホストを現在のHEK293SからGNT1を欠失 していないHEK293Fなどに変更することでより生体内に近い糖鎖修飾が施されたタンパク質の発現を行い、基質存在下で精製を行うことで試料の安定化を試みた。しかしながら、試料の付近に次正を解決するに至らず、構造決定に十分な二次元像を得ることはできなかった。本研究で得られたATP7ファミリーの発現・精製方法は今後ATP7ファミリーの機能・構造解析を進めていく大きな糧となる重要な成果である。

在本研究中，我们确定了ATP7家族与ATOX1之间的复合物结构，以阐明铜离子从ATOX1转移到ATP7家族的机制，并研究了ATP7家族在存在的运输过程中多种状态的结构。基于获得的结构，全原子分子动力学模拟（MD模拟）再现了包括脂质和水分子在内的体内条件。目的是阐明铜离子的转运途径和机制。在确定ATP7家族的结构之前，我们研究了人源ATP7A/7B的表达和纯化方法以及网格创建方法。我们成功地建立了具有足够纯度和收率的结构测定的纯化方法，并且还成功地建立了使用冷冻电子显微镜进行结构测定的网格调整方法。然而，调整后的网格不足以进行结构测定。由于样品的均匀性，可以获得准确的二维投影图像和二维平均图像。不足之处如下： 部分纯化后的样品发生聚集，未保持其二维结构。为了解决这些问题，我们对蛋白质样品的表达和纯化方法进行了具体优化。 ，我们将改进表达和纯化方法，以减少形成聚集体的蛋白质的量，具体来说，我们将改变当前删除的 HEK293S 的表达宿主。然而，我们尝试通过改变为不含该蛋白质的HEK293F，并在底物溶液存在下纯化它来表达具有与活体中更相似的糖链修饰的蛋白质，从而稳定样品。以下问题然而，无法获得足够的二维图像用于结构测定。本研究获得的表达和纯化ATP7家族的方法将为今后ATP7家族的功能和结构分析提供重要资源。成就。

项目成果

Structural basis of polyamine transport by human ATP13A2 (PARK9)

人 ATP13A2 (PARK9) 转运多胺的结构基础

• DOI: 10.1101/2021.05.28.446245
• 发表时间: 2021-05-28
• 期刊: bioRxiv
• 作者: S. Sim;Sören von Bülow;G. Hummer;E. Park
• 通讯作者: E. Park

Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity.

β3-肾上腺素能受体的冷冻电镜结构揭示了亚型选择性的分子基础。

• DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
• 发表时间: 2021
• 作者: Nagiri; C.; Kobayashi; K.; Tomita; A.; Kato; M.; Kobayashi; K.; Yamashita; K.; Nishizawa; T.; Inoue; A.; Shihoya; W.;Nureki; O.
• 通讯作者: O.

Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity.

β3-肾上腺素能受体的冷冻电镜结构揭示了亚型选择性的分子基础。

• DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
• 发表时间: 2021
• 作者: Nagiri; C.; Kobayashi; K.; Tomita; A.; Kato; M.; Kobayashi; K.; Yamashita; K.; Nishizawa; T.; Inoue; A.; Shihoya; W.;Nureki; O.
• 通讯作者: O.

Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme

V-C型CRISPR-Cas效应酶的结构

• DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 16
• 作者: Kurihara Nina;Nakagawa Ryoya;Hirano Hisato;Okazaki Sae;Tomita Atsuhiro;Kobayashi Kan;Kusakizako Tsukasa;Nishizawa Tomohiro;Yamashita Keitaro;Scott David A.;Nishimasu Hiroshi;Nureki Osamu
• 通讯作者: Nureki Osamu

Cryo-EM reveals mechanistic insights into lipid-facilitated polyamine export by human ATP13A2.

冷冻电镜揭示了人类 ATP13A2 脂质促进多胺输出的机制。

• DOI: 10.1016/j.molcel.2021.11.001
• 发表时间: 2021
• 作者: Tomita; A.; Daiho; T.; Kusakizako; T.; Yamashita; K.; Ogasawara; S.; Murata; T.; Nishizawa; T.;Nureki; O.
• 通讯作者: O.