Development of anti-scirrhous stomach cancer produced by the deep-sea actinomyces

深海放线菌抗硬胃癌的开发

基本信息

批准号：
21H03007
负责人：
坪内泰志
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka City University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和4年度では研究課題対象である抗スキルス胃癌活性を呈する深海・海洋性放線菌32株のうち3株に対して、活性物質の精製法確立および、生産菌ゲノム解析を行なった。評価した3株のうち、非タンパク質性の活性化合物を生産するものが1株、ペプチド性の活性化合物を生産するものが2株と見積もられた。非タンパク質性の活性候補分子は常法に従い、C18固相抽出、酢酸エチルを用いた液液分画、C18系Preparative HPLCシステムを用い、ほぼ単一ピークになるまで精製するに至った。ペプチド性の活性化合物は硫酸アンモニウム濃縮、親水性クロマトグラフィーの一種であるHILIC系Preparative HPLCシステムを用い、精製を進めた。活性評価には弊学附属病院で樹立した培養細胞（正常線維芽細胞及びスキルス胃癌細胞株7株のうち4株）を用い、精製各段階での活性の追跡、および比活性算出に用いた。同活性化合物群を対象とするOrbitrap-MSを用いた精密質量分析では、それらのm/zが300~800の範囲内に収まることから、分析対象とする4活性化合物は低中分子化合物であることが明らかとなった。生産菌ゲノム解析では、long read dataにはONT社MinIONシステム、short read dataにはIllumina社NovaSeq、ないしはMGI社　のDNBSEQ T7を遂行し、2プラットフォームを採用した。得られた各データからopen source codeによるバイオインフォマティクス手法でwhole genome配列を構築することに成功した。決定した6株分のゲノム配列はそのゲノムサイズが6Gb~11Gbと幅広く、コードされている16S rRNA遺伝子を指標とした分析からはいずれも新種株に相当することが見出された。解析したゲノム配列は公共データベースであるDDBJに登録申請済みである。

2020财年，我们建立了活性物质的纯化方法，并对具有抗硬质胃癌活性的32种深海和海洋放线菌菌株中的3种菌株的生产细菌进行了基因组分析。在评估的三种菌株中，估计一种菌株产生非蛋白质活性化合物，两种菌株产生肽活性化合物。使用常规方法，如 C18 固相萃取、使用乙酸乙酯的液-液分级分离和基于 C18 的制备型 HPLC 系统，将非蛋白质活性候选分子纯化至几乎单峰。使用硫酸铵浓度和基于 HILIC 的制备型 HPLC 系统（一种亲水色谱法）纯化肽活性化合物。为了进行活性评估，使用我们附属医院建立的培养细胞（正常成纤维细胞和7个硬质胃癌细胞系中的4个）跟踪纯化每个阶段的活性并计算比活性。使用Orbitrap-MS对同一组活性化合物进行精确质谱分析表明，它们的m/z落在300至800的范围内，因此待分析的四种活性化合物均为中低分子化合物。对于生产细菌基因组分析，使用了两个平台：用于长读数据的 ONT 的 MinION 系统，以及用于短读数据的 Illumina 的 NovaSeq 或 MGI 的 DNBSEQ T7。根据获得的数据，我们使用开源代码利用生物信息学方法成功构建了全基因组序列。确定的6个毒株的基因组序列具有从6Gb到11Gb的宽基因组大小，以编码的16S rRNA基因为指标进行分析表明，它们均对应于新毒株。分析的基因组序列已提交至公共数据库DDBJ。