酵素の基質誤認識を誘起するペプチドの創製

创建诱导酶底物错误识别的肽

基本信息

批准号：
20J23653
负责人：
米村開
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

巨大菌由来のシトクロムP450BM3（P450BM3）は、長鎖脂肪酸の水酸化で極めて高い触媒活性を示す。その高い触媒活性からP450BM3はベンゼンなどの非天然基質の水酸化反応への応用が期待されるが、基質認識部位が長鎖脂肪酸の取り込みに最適化されているため、それ以外の基質に対する活性は低い。一方、当研究室は、長鎖脂肪酸と似た構造を有しながらも鎖長の短い分子、擬似基質を添加すると、野生型P450BM3が非天然基質を水酸化することを明らかにしている。本申請課題では、擬似基質の作用機序を解明し、擬似基質が引き出すP450BM3の非天然活性を極限まで高めることを目指した。分子間の相互作用を視覚的に明らかにするため、P450BM3、擬似基質、種々の非天然基質の共結晶を作製し解析した。それらの比較から、ヘム上部の空間は基質に合わせて大きさを変化させられることが分かった。擬似基質添加下において種々の非天然基質が水酸化されるのは、この空間の柔軟性によるものと推察される。また、等温滴定型カロリメトリーによる実験からは、長鎖脂肪酸と擬似基質のP450BM3への取り込みの駆動力が同じであり、既存の擬似基質は長鎖脂肪酸をよく模擬していることが分かった。以上より、ヘム上部には非天然基質を取り込むに十分な空間が存在し、擬似基質は長鎖脂肪酸を模擬していることが明らかにできた。一方、擬似基質存在下での非天然基質に対する活性は天然基質に対するものと比較すると大幅に低い。そこで、擬似基質ではなく反応条件に着目して活性の向上を狙ったところ、攪拌効率の向上により酵素活性が3倍以上となった。本研究では、シトクロムP450BM3の基質認識を構造生物学的観点と熱力学的観点の両面から明らかにし、酵素活性を高める反応条件を決定した。本研究で得られた成果は、P450の利用と応用の範囲の拡大に大きく貢献すると期待できる。

源自巨细菌的细胞色素P450BM3（P450BM3）在长链脂肪酸的羟基化后表现出极高的催化活性。由于其较高的催化活性，预计P450BM3将应用于非天然底物（例如苯）的羟基化反应，但底物识别位点已针对长链脂肪酸的摄取进行了优化，因此其对其他底物的活性很低。另一方面，我们的实验室表明，当添加伪底物时，添加了与长链脂肪酸相似的结构的分子，添加了短链长度，野生型P450BM3羟基羟基羟基可将不自然的底物添加。在此应用程序中，我们旨在阐明伪底物的作用机理，并最大程度地提高p450bm3的非天然活性，该伪基底物引起其极限。为了在视觉上揭示分子之间的相互作用，制备并分析了分子的共晶，p450bm3，伪底物和各种非天然底物的相互作用。这些比较表明，血红素上方的空间的大小可以变化以适合底物。假定在添加伪底物下，各种非天然底物的羟基化是由于该空间的灵活性所致。此外，使用等热滴定热量法的实验表明，摄取长链脂肪酸和伪底物进入P450BM3的驱动力是相同的，现有的伪底物很好地模拟了长链脂肪酸。从上面可以清楚地看出，血红素顶部有足够的空间来掺入非天然底物，并且伪底物模拟了长链脂肪酸。另一方面，与天然底物相比，在伪底物存在下对非天然底物的活性显着降低。因此，当我们专注于反应条件而不是伪底物时，我们的目的是改善活性，并且由于搅拌效率的提高，酶活性的提高了三倍以上。在这项研究中，从结构生物学和热力学的角度阐明了细胞色素P450BM3的底物识别，并确定了增强酶活性的反应条件。从这项研究中获得的结果可以预期会对P450的使用范围和应用的扩展产生重大贡献。

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Analysis of the Binding Mode of Dipeptidic Molecules and Non-native Substrates to Cytochrome P450BM3

二肽分子和非天然底物与细胞色素 P450BM3 的结合模式分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
K. Yonemura;S. Ariyasu;H. Sugimoto;S. Matsuoka;O. Shoji
通讯作者：
O. Shoji

TRICKING CYTOCHROME P450BM3: CATALYSIS OF VARIOUS NON-NATIVE SUBSTRATE TRANSFORMATIONS USING DECOY MOLECULES

欺骗细胞色素 P450BM3：使用诱饵分子催化各种非天然底物转化

DOI：
10.21577/0100-4042.20170747
发表时间：
2021
期刊：
Quimica Nova
影响因子：
0.8
作者：
Stanfield Joshua;Suzuki Kazuto;Yonemura Kai;Malewschik Talita;Shoji Osami
通讯作者：
Shoji Osami

Systematic Evolution of Decoy Molecules for the Highly Efficient Hydroxylation of Benzene and Small Alkanes Catalyzed by Wild-Type Cytochrome P450BM3

野生型细胞色素 P450BM3 催化苯和小烷烃高效羟基化的诱饵分子的系统进化

DOI：
10.1021/acscatal.0c01951
发表时间：
2020
期刊：
ACS Catalysis
影响因子：
12.9
作者：
Kai Yonemura;Shinya Ariyasu;Joshua Kyle Stanfield;Kazuto Suzuki;Hiroki Onoda;Chie Kasai;Hiroshi Sugimoto;Yuichiro Aiba;Yoshihito Watanabe;Osami Shoji
通讯作者：
Osami Shoji

ペプチド分子が誘起するシトクロムP450BM3の誤作動による誘起小分子水酸化反応

肽分子诱导细胞色素P450BM3功能失常引起的小分子羟基化反应