人工金属錯体を有するヘム酵素の開発および高難度酸化反応の達成

人工金属络合物血红素酶的开发及高难度氧化反应的实现

• 批准号: 19J21931
• 负责人: 大村 慧太
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J21931/
• 关键词: シトクロムP450; 酸化反応; ヘム置換; バイオ触媒; 補因子置換

本申請課題では反応中心であるヘム補因子を合成金属錯体に置換することによるP450BM3の高機能化を目標とした．前年度の検討ではマンガンプロトポルフィリンIX結合型P450BM3（Mn-BM3）の高活性な変異体I401Pを発見した．そこで本年度はこのI401P変異体を起点とし，高機能化に向けた変異体の検討を行った．ラジカルクロック基質を用いた検討により，F87A変異の導入によって反応中間体であるアルキルラジカル種を長寿命化することを発見した．この結果は，ヘム上部に位置する87番目のフェニルアラニンが、立体障害の低いアラニンに置換されることによって，反応中間体のアルキルラジカル種に対する空間的な制御が緩和されたことによるものだと推測される．アルキルラジカル種は種々のC-H結合官能基化反応の中間体として知られ，その長寿命化を促進するF87A変異体を用いることにより，Mn-BM3による種々の非天然反応への展開が期待できる．前年度に引き続き，触媒サイクルの律速段階を調査するために速度論的同位体効果（KIE）の測定を行った．前年度の検討では，①「非競合試験」と，②「分子間競合試験」を行い，いずれの実験においてもKIEは観測されないことが確認された．そこで本年度の検討では，③等価反応点の重水素化基質を用いて反応を行い生成物比から分子内競合を求める「分子内競合試験」を実施した．その結果，野生型（ヘム結合型）P450BM3を用いた場合とMn-BM3を用いた場合のいずれにおいても大きな分子内KIEが観測された．①，②，③の結果から，Mn-BM3による水素原子引抜き過程は十分素早く進行しており，触媒サイクルの律速ではないことが推定される．したがって，水素原子引抜き以外の反応過程（例えば，基質分子のタンパク質に対する結合過程，酸化活性種の生成過程）が触媒サイクルの律速であることが推定される．

该应用的目的是通过用合成金属络合物代替反应中心的血红素辅因子来改善P450BM3的功能。在上一年的研究中，我们发现了一个高活性的突变体I401p锰原核IX结合P450BM3（MN-BM3）。因此，今年我们从这个I401p突变体开始，并检查了突变体是否增加了功能。通过使用激进时钟底物进行研究，我们发现F87a突变的引入可以导致烷基自由基物种的寿命更长，这是反应中间体。该结果猜测，位于血红素上方的第87苯丙氨酸被较小的丙氨酸所取代，该丙氨酸宽松地对反应中间体的烷基自由基物种放松了空间控制。烷基自由基物种在各种C-H键官能化反应中被称为中间体，并且通过使用促进其寿命的F87A突变体，预计它将通过MN-BM3发展为各种非天然反应。从上一年开始，测量动力学同位素效应（KIE）以研究催化循环的限速阶段。在上一年的研究中，1）进行了“非竞争性测试”和2）“分子间竞争测试”，并确认在任何一个实验中都没有观察到KIE。因此，在今年的研究中，我们进行了“分子内竞争测试”，在该测试中，我们使用等效反应点的氘化底物进行了反应，并使用产品比来确定分子内竞争。结果，当使用野生型（血红素结合型）P450BM3和使用MN-BM3时，观察到大分子内KIE。从结果①，②和③中，据估计，MN-BM3的氢原子提取过程很快进行，并且不是催化循环的限制因素。因此，据估计，除氢原子抽象以外的其他反应过程（例如，底物分子与蛋白质的结合过程，氧化活性物种的形成）是催化循环的速率限制性。

项目成果

Kristalle in Minutenschnelle: Sofortige Mikrokristallisation verschiedenster Varianten der CYP102A1‐(P450BM3)‐Hamdomane

Minutenschnelle 中的水晶：Sofortige Mikrokristallization verschiedenster Varianten der CYP102A1-(P450BM3)-Hamdomane

• DOI: 10.1002/ange.201913407
• 发表时间: 2020
• 期刊: Angew. Chem.
• 作者: J. K. Stanfield;K. Omura;A. Matsumoto;C. Kasai;H. Sugimoto;Y. Shiro;Y. Watanabe;O. Shoji
• 通讯作者: O. Shoji

A P450 Harboring Manganese Protoporphyrin IX Generates a Manganese Analog of Compound I by Activating Dioxygen

含有锰原卟啉 IX 的 P450 通过活化双氧生成化合物 I 的锰类似物

• 发表时间: 2022
• 期刊: ACS Catalysis
• 影响因子: 12.9
• 作者: Keita Omura;Yuichiro Aiba;Kazuto Suzuki;Shinya Ariyasu;Hiroshi Sugimoto;Osami Shoji
• 通讯作者: Osami Shoji

Oxygen Activation by Self-sufficient Cytochrome P450 Reconstituted with Manganese Porphyrin

用锰卟啉重构的自足细胞色素 P450 的氧活化

• 发表时间: 2019
• 作者: K. Omura;Y. Aiba;A. Matsumoto;J. K. Stanfield;H. Onoda;S. Ariyasu;H. Sugimoto;Y. Shiro;Y. Watanabe;O. Shoji
• 通讯作者: O. Shoji

Oxygen Activation by Manganese Porphyrin in the Self-sufficient Flavocytochrome P450BM3

自给自足的黄细胞色素 P450BM3 中锰卟啉的氧活化

• 发表时间: 2019
• 作者: K. Omura;Y. Aiba;A. Matsumoto;J. K. Stanfield;H. Onoda;S. Ariyasu;H. Sugimoto;Y. Shiro;Y. Watanabe;O. Shoji
• 通讯作者: O. Shoji

Crystals in minutes: instant on-site microcrystallisation of various flavours of the CYP102A1 (P450BM3) haem domain

几分钟内形成晶体：各种口味的 CYP102A1 (P450BM3) 血红素结构域即时现场微结晶

• DOI: 10.1002/anie.201913407
• 发表时间: 2020
• 期刊: Angew. Chem. Int. Ed.
• 作者: Stanfield;J. K.;Omura;K.;Matsumoto;A.;Kasai;C.;Sugimoto;H.;Shiro;Y.;Watanabe;Y.;Shoji;O.
• 通讯作者: O.