基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発

利用底物模拟物控制羟化酶开发细胞内物质转化系统

基本信息

批准号：
19J23669
负责人：
唐澤昌之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

水酸化酵素であるP450BM3 (BM3) は、擬似基質（デコイ分子）によって基質特異性を変換できる。これまでに、BM3を発現させた大腸菌にデコイ分子を取り込ませることで、菌体内の補酵素再生系を利用して非天然基質の水酸化が進行することを明らかにしている。また、外膜タンパク質OmpFの変異体をBM3と共発現させることで、菌体反応が促進されることを見出している。OmpF変異体の機能を精査するため、ピレンを部分骨格として有するデコイ分子を模した蛍光分子を合成し、大腸菌への取り込みを評価した。蛍光分子を大腸菌の懸濁液に加えてインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、OmpF変異体を発現させた大腸菌からのみ明瞭な蛍光が観測された。また、培養後の上清の紫外可視吸収スペクトルを測定し、蛍光分子の吸収から菌体への取り込み効率を算出したところ、野生型OmpFを発現させた大腸菌では取り込み効率が11%であったのに対し、OmpF変異体を発現させた場合では74%に増加した。以上の結果から、OmpF変異体が擬似基質の取り込みを促進していることが示唆された。また、天然物が擬似基質として機能するかを調査するため、アシルホモセリンラクトン(CnHSL)とアシルホモセリン(CnHS)の存在下、BM3によるベンゼンの水酸化を行った。AHSLの中では炭素鎖8のものが、AHSの中では9のものが酵素反応を効果的に促進し、C9HSの存在下、BM3は毎分24回ベンゼンを酸化した。X線結晶構造解析から、C12HSLのラクトン環はC16HSのカルボキシ基よりもBM3の基質結合部位の奥に固定化されていることが明らかとなり、酵素反応で観測された鎖長依存性の差は、両者の結合状態の違いに起因していると推測している。菌体自身がデコイ分子を生合成する新しい菌体触媒の開発につながることが期待される。

P450BM3 (BM3) 是一种羟化酶，可以用假底物（诱饵分子）改变其底物特异性。到目前为止，我们已经证明，通过将诱饵分子掺入表达 BM3 的大肠杆菌中，可以利用细菌内的辅酶再生系统进行非天然底物的羟基化。我们还发现，外膜蛋白 OmpF 的突变体与 BM3 共表达可促进细菌细胞反应。为了研究 OmpF 突变体的功能，我们合成了一种模仿诱饵分子的荧光分子，以芘作为部分主链，并评估了其对大肠杆菌的吸收。当将荧光分子添加到大肠杆菌的悬浮液中并孵育并在显微镜下观察时，仅在表达OmpF突变体的大肠杆菌中观察到清晰的荧光。此外，我们测量了培养后上清液的紫外-可见吸收光谱，并根据荧光分子的吸收计算了细菌细胞的摄取效率，发现表达野生型OmpF的大肠杆菌的摄取效率为11%。相反，当表达 OmpF 突变体时，这一比例增加至 74%。这些结果表明OmpF突变体促进了假底物的摄取。此外，为了研究天然产物是否充当假底物，在酰基高丝氨酸内酯 (CnHSL) 和酰基高丝氨酸 (CnHS) 存在的情况下，苯被 BM3 羟基化。 AHSL中的8碳链和AHS中的9碳链有效促进了酶促反应，并且在C9HS存在下，BM3每分钟氧化苯24次。 X射线晶体结构分析表明，C12HSL的内酯环比C16HS的羧基更深入地固定在BM3的底物结合位点中，并且在酶促反应中观察到的链长度依赖性的差异是由于推测这这是由于两者之间的键合状态不同造成的。预计这将导致新的细菌细胞催化剂的开发，使细菌细胞本身能够生物合成诱饵分子。