基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発

利用底物模拟物控制羟化酶开发细胞内物质转化系统

基本信息

批准号：
19J23669
负责人：
唐澤昌之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

水酸化酵素であるP450BM3 (BM3) は、擬似基質（デコイ分子）によって基質特異性を変換できる。これまでに、BM3を発現させた大腸菌にデコイ分子を取り込ませることで、菌体内の補酵素再生系を利用して非天然基質の水酸化が進行することを明らかにしている。また、外膜タンパク質OmpFの変異体をBM3と共発現させることで、菌体反応が促進されることを見出している。OmpF変異体の機能を精査するため、ピレンを部分骨格として有するデコイ分子を模した蛍光分子を合成し、大腸菌への取り込みを評価した。蛍光分子を大腸菌の懸濁液に加えてインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、OmpF変異体を発現させた大腸菌からのみ明瞭な蛍光が観測された。また、培養後の上清の紫外可視吸収スペクトルを測定し、蛍光分子の吸収から菌体への取り込み効率を算出したところ、野生型OmpFを発現させた大腸菌では取り込み効率が11%であったのに対し、OmpF変異体を発現させた場合では74%に増加した。以上の結果から、OmpF変異体が擬似基質の取り込みを促進していることが示唆された。また、天然物が擬似基質として機能するかを調査するため、アシルホモセリンラクトン(CnHSL)とアシルホモセリン(CnHS)の存在下、BM3によるベンゼンの水酸化を行った。AHSLの中では炭素鎖8のものが、AHSの中では9のものが酵素反応を効果的に促進し、C9HSの存在下、BM3は毎分24回ベンゼンを酸化した。X線結晶構造解析から、C12HSLのラクトン環はC16HSのカルボキシ基よりもBM3の基質結合部位の奥に固定化されていることが明らかとなり、酵素反応で観測された鎖長依存性の差は、両者の結合状態の違いに起因していると推測している。菌体自身がデコイ分子を生合成する新しい菌体触媒の開発につながることが期待される。

羟化酶P450BM3（BM3）可以通过假底物（诱饵分子）转换底物特异性。到目前为止，已经揭示了通过将诱饵分子掺入表达BM3的大肠杆菌中，使用细菌中的辅酶再生系统进行非天然底物的羟基化进行。还发现，与BM3共表达外膜蛋白OMPF的突变体可促进细胞反应。为了检查OMPF突变体的功能，合成了模仿诱饵分子作为部分主链的荧光分子合成，并评估了其对大肠杆菌的摄取。将荧光分子添加到大肠杆菌的悬浮液中并孵育，并在显微镜下观察到清晰的荧光，仅在表达OMPF突变体的大肠杆菌中观察到清晰的荧光。此外，测量了培养后上清液的紫外线吸收光谱，并计算了吸收到细菌细胞中荧光分子摄取的效率。在表达野生型OMPF的大肠杆菌中，摄取效率为11％，而当表达OMPF突变体时，摄取效率为74％。以上结果表明，OMPF突变体促进了模拟底物的摄取。此外，为了研究天然产物是否起伪底物的作用，在存在酰基霍明氨基内酯（CNHSL）和酰基homoserine（CNHS）的情况下，苯用BM3羟基被BM3羟基化。在AHSL中，碳链8可有效促进酶反应，在存在C9HS的情况下，有效促进了碳链8。 BM3每分钟24次氧化苯。 X射线晶体结构分析表明，C12HSL的内酯环比C16HS的羧基更固定在BM3的底物结合位点中，并且据推测，由于两者之间的结合状态之间的差异，酶促反应中链长依赖性的差异差异。希望这将导致新的细胞催化剂的发展，这些细胞催化剂使细菌本身可以生物合成诱饵分子。