新規スクリーニング法を用いた骨細胞特異的なメカニカルストレス受容体の同定

使用新的筛选方法鉴定骨细胞特异性机械应力受体

基本信息

批准号：
19K18452
负责人：
佐々木文之
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

骨が運動などのメカニカルストレスの負荷により堅牢さを保っていることを、我々は経験的に理解しているが、その分子機序については不明な点が多い。本計画では、独自に構築した骨細胞特異的なメカニカルストレス応答遺伝子、スクレロスチン（遺伝子名: Sost）を指標とした高感度スクリーニング法を用いて、骨細胞特異的に発現している新規メカニカルストレス受容体の同定を試みることを目的とした。CRISPR/Cas9法を用いて、骨細胞株IDG-SW3のSostの翻訳領域に、蛍光タンパク質DsRed-Express2あるいは発光酵素ルシフェラーゼの一種であるNanoLucの部分的な遺伝子配列（タンパク質名: HiBiT）を挿入した２種類のレポーター骨細胞株の樹立を行った。前者のSost-DsRed-Express2ノックインレポーター細胞株を１次スクリーニング、後者のSost-HiBiノックイン細胞株を２次スクリーニングで使用することを計画し、まずPool型shRNAライブラリーを用いて前者の細胞株に遺伝子導入し、１次スクリーニングを実施しているところである。また本研究の実施過程において、骨細胞に発現しているメカニカルストレス感受性イオンチャンネルPiezo1が、Aktシグナル経路を介してSostの発現抑制に寄与していることをin vitroの解析にて明らかにすることができた（Sasakiら, BBRC, 2020）。本研究成果と同時期にin vivo解析において、骨芽細胞-骨細胞系に発現しているPiezo1が骨形成に必須であることが報告された（Liら, eLife, 2019）。これらの結果から、Piezo1は骨細胞におけるメカノセンサーの一つであることが明らかとなった。

我们从经验上了解到，由于运动等机械应力载荷，骨骼保持健壮，但是关于它们的分子机制有许多未知数。该项目旨在使用使用Sclerostin（基因名称：SOST）（一种骨细胞特异性的机械应力响应基因）使用独特构建的高度敏感筛选方法在骨细胞中特异性表达的新型机械应力受体，该方法构建为指数。使用CRISPR/CAS9方法，建立了两种报告骨细胞系，其中将荧光蛋白DSRED-Express2或Nanoluc的部分基因序列（蛋白质名称：Hibit）（一种发光酶荧光素酶）插入骨细胞系IDG-SW3的刺激性区域的一种。计划在次级筛选中使用以前的SOST-DSRED-EXPRESS2敲入报告基因细胞系，并计划将后者的SOST-HIBI敲入细胞系用于次级筛选，首先使用泳池型shrna库转染以前的细胞系，并且现在进行了主要筛选。此外，在这项研究的实施过程中，有可能阐明体外分析，即在骨细胞中表达的机械应力敏感离子通道压电1有助于通过AKT信号传导途径抑制SOST表达（Sasaki等人，Sasaki等人，BBRC，2020年）。在这项研究的发现同时，据报道，在成骨细胞 - 骨细胞谱系中表达的Piezo1对于骨形成至关重要（Li等，Elife，2019）。这些结果表明，压电是骨细胞中的机械传感器之一。