诱导骨髓间充质干细胞分化为单倍体雄性生殖细胞

非梗阻性无精症是导致男性不育的主要原因之一，且目前尚无有效治疗手段。本研究在以往的工作基础上，首先拟采用细胞内激酶抑制剂处理、高浓度胚胎干细胞提取物诱导和四基因（OCT4, KLF4, c-MYC, SOX2）逆转录病毒载体转染相结合的方式促使骨髓间充质干细胞发生胚胎干细胞样变，以形成诱导性多能细胞，提高细胞的多向分化能力。随后利用视黄酸刺激和细胞制备拟胚体的方法促使诱导性多能细胞发生向生精细胞的分化。最后采用与生殖嵴细胞共培养和生精小管移植的方法促进诱导的细胞发生向生精细胞的进一步分化，并最终进入减数分裂形成单倍体的精子细胞或精子。此项研究的开展可以在一定程度上揭示干细胞分化的机理，并为临床治疗无精症提供理论基础。

本研究基本按照项目申请书设计的技术路线开展，其中个别步骤在参考最新文献的基础上做出了相应的修改。由于本研究难度大耗时长，目前已完成诱导的生殖细胞受体小鼠曲细精管移植一个月后细胞分化状况的检测，移植三个月和五个月后分化状况的检测有待后续进行。.从小鼠骨髓和脂肪组织中成功分离培养出间充质干细胞。采用四因子（OCT4, KLF4, c-MYC, SOX2）逆转录病毒转染的方式成功诱导间充质干细胞去分化产生胚胎干细胞（ESC）样变。产生的ESC样细胞表达碱性磷酸酶、细胞多功能相关基因；可以自发形成拟胚体，拟胚体中细胞形成三胚层分化。由于脂肪组织来源的间充质干细胞具有抵抗化疗药物和增殖迅速的特点，因此在随后的研究中以脂肪组织来源的间充质干细胞替代了骨髓来源的间充质干细胞。.经去分化形成的ESC样细胞在被诱导生成外胚层和原始生殖细胞过程中细胞集落形态出现改变。向外胚层和原始生殖细胞诱导过程中细胞多能性相关基因（Oct3, Sox2, Klf4, and Nanog）和与生殖细胞形成相关的Blinp-1和Stella基因转录量升高。在从ESC样细胞到外胚层样细胞及原始生殖样细胞的诱导过程中细胞内组蛋白甲基化酶H3K9me2的表达水平逐渐下降；H3K27me3的表达水平开始出现下降，随后轻微上升。采用免疫磁珠的方法从诱导的细胞中获取了SSEA-1阳性细胞，分离出的细胞表达原始生殖细胞表面标志Blimp-1和Stella。与未经诱导的间充质干细胞和ESC样变细胞相比， 诱导生成的原始生殖细胞样细胞其H19和Igf2r基因的甲基化程度明显降低，类似于处于胚胎发育中的原始生殖细胞的甲基化状态。.获取的原始生殖细胞样细胞在移植进入受体小鼠曲细精管一个月后聚集在靠近管壁的部位，尚未在管腔内形成典型的精子发生样结构。后续三个月和五个月的移植结果有待进一步观察。.研究取得的部分结果在国际专业杂志发表英文论文2篇(Cell Biol Int 2012;36:857-862; 2012;36:491-495)，另有1篇英文论文已投稿。在国内核心期刊发表中文论文2篇（中国男科学杂志2011;25(6):3-7 2013;27(6):3-7）。项目进行中培养在职硕士研究生1名。

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