Roles and their molecular mechanisms of replication barrier zones programmed on chromosome for genome stability maintenance

染色体上编程的复制屏障区在维持基因组稳定性中的作用及其分子机制

基本信息

批准号：
21K06120
负责人：
秋山昌広
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

複製フォークはDNAを複製しながらゲノム上を進行する。この時、複製フォークでは、DNAポリメラーゼがチミンを含む4種類の基質を重合してDNAを合成する。チミンの欠乏状態では、この酵素反応の基質が一つ不足するために、複製フォークの進行が阻害される。それだけでなく、細胞が迅速に、かつ、急激に生存力を失う「チミン飢餓死」という現象を生じる。チミン飢餓死は今から60年以上前に発見され、この現象を起こす抗菌剤や抗がん剤が医療現場で長年広く使用されている。しかし、細胞内の複製フォークの動態が、微生物でも真核生物でもゲノム全体のレベルで明らかでないため、未だにチミン飢餓死のメカニズムは謎のままである。研究代表者は、チミン不足の大腸菌細胞で、複製フォーク進行がゲノムのどの位置でも同じように阻害されるのではなく、複製開始点oriCの両側近傍に位置する約200kbのゲノム領域（複製遅延領域FTZ: Fork Trapping Zone）で高頻度にに阻害されることを見出した。さらに、これらの二つのFTZで囲まれたoriC周辺領域はチミン飢餓死で消失するゲノムDNA領域と一致した。そこで、本研究では、「チミン不足時に、選択的にFTZで複製フォークの進行を阻害する仕組みと、その役割は何か」というオリジナルな問いに対する答えを明らかにして、チミン飢餓での複製阻害とゲノム不安定化のメカニズムの解明を目指す。これまでに、oriC左側のFTZ領域(L-FTZ)のコア領域を含む人工染色体(L-FTZ人工染色体)を構築した。また、複製フォークの解析を進めるために、このL-FTZ人工染色体を大腸菌の複製タンパク質を用いてセルフリー複製したり、大腸菌細胞内で安定に維持したりすることができた。さらに、複製フォークの動態をより詳細に解析するために、DNAポリメラーゼのゲノム分布を決定できる実験系を新たに構築した。

复制叉在复制 DNA 时沿着基因组移动。此时，在复制叉处，DNA聚合酶聚合包括胸腺嘧啶在内的四种底物，从而合成DNA。在胸腺嘧啶缺乏的状态下，这种酶促反应的一种底物缺失，复制叉的进展受到抑制。不仅如此，还会发生一种称为“胸腺嘧啶饥饿死亡”的现象，细胞迅速失去活力。胸腺嘧啶饥饿死亡早在60多年前就被发现，引起这种现象的抗菌和抗癌药物多年来已在医学领域广泛应用。然而，胸腺嘧啶饥饿死亡的机制仍然是个谜，因为微生物和真核生物的细胞内复制叉的动态在全基因组水平上尚不清楚。主要研究人员发现，在缺乏胸腺嘧啶的大肠杆菌细胞中，复制叉的进展在基因组的任何位置都没有以相同的方式受到抑制，而是在位于复制叉两侧附近的约 200 kb 基因组区域（复制延迟区域）中。复制起点 oriC 被发现 FTZ（叉捕获区）经常被抑制。此外，被这两个 FTZ 包围的 oriC 周围的区域与因胸腺嘧啶饥饿而死亡时消失的基因组 DNA 区域一致。因此，在本研究中，我们澄清了最初的问题“胸腺嘧啶缺乏时FTZ选择性抑制复制叉进展的机制是什么，其作用是什么？”的答案，旨在阐明基因组不稳定的机制。至此，我们已经构建了一条包含oriC左侧FTZ区域（L-FTZ）核心区域的人工染色体（L-FTZ人工染色体）。此外，为了进一步分析复制叉，我们能够使用大肠杆菌复制蛋白无细胞复制这种L-FTZ人工染色体，并将其稳定地维持在大肠杆菌细胞内。此外，为了更详细地分析复制叉的动态，我们构建了一个新的实验系统，可以确定DNA聚合酶的基因组分布。