CRISPRスクリーニングによるTCR刺激依存的Tregエピゲノム制御因子の同定

通过 CRISPR 筛选鉴定 TCR 刺激依赖性 Treg 表观基因组调节因子

基本信息

批准号：
21K07077
负责人：
中島啓
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07077/
关键词：
制御性T細胞 TSDR DNA脱メチル化 CRISPRスクリーニング TCR刺激

项目摘要

転写因子Foxp3を発現した制御性T細胞(Treg)は広範な免疫抑制機能を示し、自己免疫寛容と免疫恒常性の維持に必須の役割を担っている。これまでにTregへの運命決定はFoxp3発現の有無ではなく、Foxp3遺伝子座のTreg-specific demethylation region[TSDR]と呼ばれる発現制御領域のDNA脱メチル化により補完されることが分かってきた。しかしながら、現時点でこのエピゲノム形成の分子基盤はほとんど明らかにされていない。そのため、例えばin vitroでナイーブT細胞からT細胞受容体（TCR）刺激とサイトカインTGF-βを与えることで誘導されるiTreg（in vitro-induced Treg）の培養系では、安定的なFoxp3発現を獲得した細胞を誘導することが出来ず、Tregを用いた細胞療法にとって大きな障害となっている。本研究はiTreg培養系において、TSDR脱メチル化に重要な分子をCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによる網羅的なスクリーニングで同定することを目指す。そして、同定した標的因子を介して安定的にFoxp3発現を獲得したiTregを誘導し、治療応用への可能性を探索する。2022年度は、昨年度に引き続きCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによるスクリーニングを可能にするiTreg培養系の確立を目指した。具体的には、sgRNAをレトロウイルス（RV）感染で導入後、iTreg培養を行い、誘導されたFoxp3陽性細胞を抗原提示細胞で再刺激を行うことで、Foxp3発現の有無によりTSDRがほぼ完全に脱メチル化した細胞集団とメチル化状態の細胞集団に分離することに成功した。従って、本培養系を用いてCRISPRスクリーニングが可能になると考えられる。

表达转录因子FOXP3的调节性T细胞（Tregs）表现出广泛的免疫抑制功能，并且在维持自身免疫性耐受性和免疫稳态方面起着至关重要的作用。迄今为止，已经发现，Treg的命运确定不是通过存在或不存在FOXP3表达来补充，而是通过在FOXP3基因座的表达控制区域的DNA去甲基化[TSDR]。然而，目前尚不清楚这种表观基因组形成的分子基础。因此，例如，体外诱导的Treg（ITREGS）培养系统是由刺激T细胞受体（TCR）诱导的，并在体外天真T细胞中给出了细胞因子TGF-β，无法诱导稳定的FOXP3表达的细胞，这是使用Tregs细胞治疗的主要障碍。这项研究旨在通过使用CRISPR-CAS9 SGRNA库进行全面筛选来确定ITREG培养系统中TSDR脱甲基化重要的分子。然后诱导通过确定的目标因素稳定地获得FOXP3表达的ITREGS，并探索了治疗应用的可能性。在2022年，我们旨在建立一个ITREG文化系统，该系统允许使用CRISPR-CAS9 SGRNA库进行筛选，从去年开始。具体而言，在逆转录病毒（RV）感染引入SGRNA之后，进行了ITREG培养，并用抗原呈递细胞将诱导的FOXP3阳性细胞重新刺激，并将TSDR成功分为几乎完全脱甲基化的细胞的群体，并根据存在或不存在Foxp3表达的甲基化细胞的种群。因此，人们认为使用主要培养系统将进行CRISPR筛查。