Investigation of the molecular mechanism for myoblast fusion using fluorescence polarization imaging

利用荧光偏振成像研究成肌细胞融合的分子机制

基本信息

批准号：
21K06750
负责人：
佐藤啓介
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06750/
关键词：
アクチン蛍光偏光筋芽細胞細胞融合

项目摘要

昨年度の研究により、細胞融合をリアルタイム蛍光観察するにあたり、①C2C12細胞の融合頻度を上げるための工夫、②融合間近な細胞を判別する方法の検討、③細胞密度が高いことに起因する顕微鏡観察の困難の解決、が必要なことが明らかになった。本年度はこれらの課題に取り組んだ。①について、膜脂質に作用して分化状態を保持したまま可逆的に融合を阻害することが報告されている薬剤をまず検討した。融合を阻害する薬剤の作用は確認できたが、薬剤をwashoutする際の培地交換で、密になった細胞がシート状に剥離する現象が起き、顕微鏡観察に持ち込むことができなかった。この薬剤を使用するためには、細胞密度が高くなりすぎない状態（具体的には、コンフルエントにならない状態）で細胞融合させる必要があると考えられた。②について、小胞体やミトコンドリアといった、細胞内小器官の形態マーカーの導入を試みたが、親株と同様の融合能を保持したセルラインを得るのが困難であり、いったん中断した。③について、蛍光偏光プローブを発現するC2C12細胞を、ごく少数、プローブを発現しないC2C12細胞の集団に混ぜることにより、細胞が高密度であっても高精細な顕微鏡観察が可能になるか検討した。比率を検討した結果、顕微鏡観察自体は可能になったが、融合の頻度の低さが原因となり、融合の現場を撮影することは困難であった。上記検討の結果から、細胞融合を蛍光偏光イメージングで観察するためには、より効率良くC2C12細胞を分化・融合させる実験系が必要であると考えられた。そこで、培養・分化条件を根本的に見直した。その結果、細胞密度をコンフルエントにせずに、従来法より高効率でC2C12細胞を分化・融合させる条件を見出した。さらに、この分化誘導法を、上述の細胞融合を可逆的に阻害する薬剤の使用と組み合わせることで、細胞融合の頻度を上昇させることに成功した。

去年的一项研究表明，当观察细胞融合的实时荧光时，1）有必要：1）努力增加C2C12细胞的频率，2）研究方法以鉴定接近融合的细胞，3）解决由于高细胞密度而引起的显微镜观察的困难。今年，我们解决了这些问题。关于①，我们首先检查了已报告对膜脂质作用的药物，并在保留其分化状态的同时可逆地抑制融合。尽管确认了抑制融合的药物的作用，但是当药物被洗掉时改变培养基时，密集的细胞脱离片段，并且无法将产物带入微观观察中。为了使用这种药物，人们认为在细胞密度不高的状态下需要细胞融合（具体来说，在不汇合的状态下）。关于②，我们试图引入细胞内细胞器的形态标记物，例如内质网和线粒体，但是很难获得与父母菌株保持相同融合能力的细胞系，因此停止了。关于③，我们研究了即使通过将表达荧光极化探针的C2C12细胞混合到少数不表达探针的C2C12细胞中的C2C12细胞通过将表达荧光极化探针的C2C12细胞混合在一起，即使细胞是高密度的可能性。由于对比率的检查，显微镜观察变得可能是可能的，但是由于融合的频率较低，很难拍摄融合的位点。基于上述研究的结果，人们认为，为了通过荧光极化成像观察细胞融合，必须进行实验系统，允许C2C12细胞的更有效的分化和融合。因此，对文化和分化条件进行了从根本上进行审查。结果，我们发现与传统方法相比，C2C12细胞分化和融合的条件，而没有细胞密度汇合。此外，这种诱导分化的方法与可逆性抑制细胞融合的药物的使用相结合，因此，它在增加细胞融合的频率方面已经成功。

项目成果

期刊论文数量（9）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ユニバーサル分子配向プローブPOLArISの開発と細胞骨格動態解析への応用

通用分子取向探针POLArIS的研制及其在细胞骨架动力学分析中的应用

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
佐藤啓介;杉﨑綾奈;千葉和義;齊藤健太;川岸将彦;Shalin B. Mehta;白水美香子;谷知己;寺田純雄
通讯作者：
寺田純雄

F-actin配向プローブPOLArISactとF-actin複合体のクライオ電子顕微鏡解析と、それに基づく改良型POLArISactの開発

F-肌动蛋白定向探针 POLArISact 和 F-肌动蛋白复合物的冷冻电镜分析以及基于其的改进 POLArISact 的开发

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
池田一穂;岡田康志;佐藤啓介,杉﨑綾奈,鎌田勝彦,久野玉雄,桂一茂,白水美香子,寺田純雄
通讯作者：
佐藤啓介,杉﨑綾奈,鎌田勝彦,久野玉雄,桂一茂,白水美香子,寺田純雄

Development of POLArIS, a versatile probe for multi-color/multi-target orientation imaging in living cells

开发 POLArIS，一种用于活细胞中多颜色/多目标定向成像的多功能探针

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Keisuke Sato;Nori Nakai-Kadowaki;Ayana Sugizaki;Kazuyoshi Chiba;Kenta Saito;Masahiko Kawagishi;Yuri Tomabechi;Shalin B. Mehta;Hirokazu Ishii;Naoki Sakai;Hiromasa Ka;Mikako Shirouzu;Tomomi Tani;Sumio Terada
通讯作者：
Sumio Terada

分子配向プローブNanobody-based POLArISの開発と、それによる多色/多標的の分子配向イメージング

基于纳米抗体的分子取向探针POLArIS的研制及其多色/多目标分子取向成像