出芽酵母の小胞体・ゴルジ体に局在する機能未知必須膜タンパク質の解析

酿酒酵母内质网和高尔基体中功能未知的必需膜蛋白的分析

基本信息

批准号：
06J11506
负责人：
佐藤啓介
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、主に必須遺伝子YDR367Wにコードされる機能未知膜タンパク質Ydr367Wの解析を行った。スフィンゴ脂質は、真核細胞の膜を構成する脂質で、セラミド骨格を有するものを指す。セラミドの新規合成は小胞体で行われ、さらにゴルジ体に運ばれて修飾を受ける。出芽酵母においては、イノシトールリン酸が付加されてIPCとなり、さらにマンノースが付加されてMIPCに、再びイノシトールリン酸が付加されてM(IP)_2Cとなる。この修飾の過程で、最初のIPC合成だけが酵母の生育に必須である。本研究ではYDR367Wの温度感受性変異株を作製してサプレッサースクリーニングを行い、AUR1を同定した。AUR1は、IPC合成を行うIPCシンターゼをコードすると報告されていた。両者の物理的相互作用を検証するため、膜を界面活性剤で可溶化し、免疫沈降実験を行った。その結果、Ydr367WとAur1がin vivoで複合体を形成することを見出した。野生株および温度感受性変異株からAur1を含むIPC合成酵素を免疫学的に精製し活性測定した結果、温度感受性変異株から精製したIPC合成酵素は野生型のものと比べほとんど活性を失っており、Ydr367WはIPC合成酵素活性に必須なサブユニットと推定された。さらに、Ydr367Wは一部がゴルジ体エンドプロテアーゼKex2によりプロセシングされていることを見出した。以上から、YDR367WをKEI1(Kex2-cleavable protein Essential for IPC synthesis 1)と命名した。以上の成果はアメリカ細胞生物学学会の発行する国際学術誌に投稿し、現在審査中である。

今年，我们主要分析了Ydr367W，一种由必需基因YDR367W编码的功能未知的膜蛋白。鞘脂是构成真核细胞膜并具有神经酰胺骨架的脂质。神经酰胺的从头合成发生在内质网中，并进一步转运到高尔基体，在那里进行修饰。在酿酒酵母中，添加肌醇磷酸盐形成IPC，进一步添加甘露糖至MIPC，再次添加肌醇磷酸盐形成M(IP)_2C。在此修饰过程中，只有第一次 IPC 合成对于酵母生长至关重要。在本研究中，我们创建了 YDR367W 的温度敏感突变株，进行了抑制子筛选，并鉴定了 AUR1。据报道，AUR1 编码执行 IPC 合成的 IPC 合酶。为了验证两者之间的物理相互作用，用表面活性剂溶解膜并进行免疫沉淀实验。结果，我们发现Ydr367W和Aur1在体内形成复合物。从野生型菌株和温度敏感突变株中免疫纯化包括Aur1的IPC合酶并测量其活性，结果发现从温度敏感突变株纯化的IPC合酶与野生型相比几乎丧失了活性。 Ydr367W 被认为是 IPC 合酶活性的重要亚基。此外，我们发现 Ydr367W 部分由高尔基体内切蛋白酶 Kex2 加工。据此，YDR367W被命名为KEI1（Kex2-cleavable Protein Essential for IPC Synthesis 1）。上述结果已提交至美国细胞生物学会出版的国际学术期刊，目前正在审稿中。