翻訳速度に依存したタンパク質フォールディング解析

翻译率依赖性蛋白质折叠分析

基本信息

批准号：
21H04763
负责人：
田口英樹
金额：
$ 26.87万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

初年度は以下の研究を推進した。【研究１】A) 翻訳速度に依存したフォールディングをするタンパク質の大規模同定：翻訳時フォールディングが翻訳伸長速度に影響を受けることが申請者らの研究を含めてこれまでに示唆されてきており、一部証明されている。しかし、プロテオームレベルでどうインパクトを及ぼすのか全く不明であった。そこで、翻訳伸長速度に影響を及ぼす翻訳因子の変異株、特定tRNAの欠損株などにおいて、どのようなタンパク質の発現やフォールディング（可溶性）が影響を受けうるのかプロテオームレベルで調べた。B) 再構築型無細胞翻訳系を用いた翻訳時フォールディング解析：翻訳速度に依存したフォールディングを分子レベルで詳細に調べるには再構成系が必須である。研究代表者がこれまで成果を挙げてきた大腸菌の翻訳再構成系（PUREシステム）を使ったフォールディング研究、シャペロン研究をベースとして、翻訳速度とフォールディングの関連が示唆されたタンパク質をPUREシステムで翻訳させて解析した。さらに、PUREシステムにシャペロンを加えることでフォールディングにどのような変化が及ぶかも調べた。【研究2】　生細胞内でのフォールディング可視化と分子機構：近年、ヒトの生細胞のサイトゾル内での翻訳過程を実時間でトラッキングする手法が開発されている。本研究では、この手法を発展させて、生きた細胞内で翻訳に共役したフォールディングを直接可視化することを目標の一つとしている。具体的には、天然構造を認識し、変性状態には結合しない抗体断片（構造認識Fab）を用いて、細胞内でのフォールディングを可視化する。R3年度はカナダで開発された構造認識Fabをコードする遺伝子を入手し、その特徴を調べるところから研究をスタートした。

第一年，我们推进了以下研究。 [研究1] A) 折叠依赖于翻译速率的蛋白质的大规模鉴定：有人提出，翻译过程中的折叠受到翻译延伸率的影响，包括申请人的研究部分证实。然而，目前还完全不清楚它将如何对蛋白质组水平产生影响。因此，我们在蛋白质组水平上研究了影响翻译延伸率的翻译因子突变菌株和缺乏特定tRNA的菌株中哪些蛋白质表达和折叠（溶解度）可能受到影响。 B) 使用重建的无细胞翻译系统进行翻译折叠分析：重建的系统对于在分子水平上详细研究翻译速率依赖性折叠至关重要。基于研究主任迄今为止使用大肠杆菌翻译重构系统（PURE系统）进行的折叠研究和伴侣蛋白研究，使用PURE系统翻译了被认为与翻译率和折叠之间存在关系的蛋白质进行了分析。此外，我们还研究了在 PURE 系统中添加分子伴侣如何改变折叠。 [研究2]活细胞折叠和分子机制的可视化：近年来，已经开发出实时跟踪人类活细胞胞浆中翻译过程的方法。在这项研究中，我们的目标之一是开发这种方法并直接可视化活细胞中的平移耦合折叠。具体来说，我们使用识别天然结构且不与变性状态结合的抗体片段（结构识别 Fab）来可视化细胞内的折叠。在R3年，我们获得了在加拿大开发的编码结构识别Fab的基因，并通过检查其特性开始了我们的研究。