1分子イメージングによるシャペロニンの作用機構の解明

通过单分子成像阐明伴侣蛋白的作用机制

• 批准号: 11780440
• 负责人: 田口 英樹
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780440/
• 关键词: 分子シャペロン; GroEL; 1分子イメージング; フォールディング

1分子のレベルでのシャペロニンGroELとGroESが結合解離するようす、およびタンパク質の折れ畳みの1分子観察の統計的な解析から、これまで知られていない新しいGroEL/ES複合体の中間体があることを提唱した。さらにこの新しい中間体の存在を確かめるために、ATP加水分解の速度論的な解析を行った。また、シャペロニンと変性タンパク質との相互作用の1分子イメージングを行い、シャペロニン機能の全貌を1分子レベルで調べる手がかりを得た。1分子のシャペロニンが機能するようすをリアルタイムで調べるための第一歩としてシャペロニンGroELとGroESが結合解離するようすを1分子レベルで観察することに成功した。また、この実験系を発展させて変性タンパク質の折れ畳みの1分子観察を行った。Green Fluorescent Protein(GFP)とGroEL変異体を使用して1分子タンパク質フォールディングを見ることができた。以上の観察の時間経過を統計的に解析した結果、これまで知られていなかった新しいGroEL/ES複合体を検出することができた。

对伴侣蛋白 GroEL 和 GroES 在单分子水平上的结合和解离的统计分析以及蛋白质折叠的单分子观察表明，存在一种新的、以前未知的 GroEL/ES 复合物中间体。此外，为了确认这种新中间体的存在，我们进行了 ATP 水解的动力学分析。此外，我们对伴侣蛋白与变性蛋白之间的相互作用进行了单分子成像，并获得了在单分子水平上研究伴侣蛋白整体功能的线索。作为实时研究单分子伴侣蛋白功能的第一步，我们成功地在单分子水平观察了伴侣蛋白 GroEL 和 GroES 的结合和解离。我们还开发了这个实验系统来观察变性蛋白质的单分子折叠。我们能够使用绿色荧光蛋白 (GFP) 和 GroEL 突变体观察单分子蛋白质折叠。通过对上述观察的时间过程进行统计分析，我们能够检测到以前未知的新 GroEL/ES 复合物。

项目成果

Pack C-G.: "Analysis of interaction between chaperonin GroEL and its substrate using Fluorscence correlation spectroscopy"Cytometry. 36. 247-253 (1999)

Pack C-G.：“使用荧光相关光谱分析伴侣蛋白 GroEL 与其底物之间的相互作用”细胞计数法。

Watanabe,Y.: "Heat-inactivated proteins managed by DnaKJ-GrpE-ClpB chaperones are released as a chaperonin-recognizable nonnative form."J. Biol.Chem.. 275. 12388-12392 (2000)

Watanabe,Y.：“由 DnaKJ-GrpE-ClpB 伴侣管理的热失活蛋白质以伴侣蛋白可识别的非天然形式释放。”J.

Aoki K.: "GroEL binds artificial proteins with random sequences"J.Biol.Chem.. (in press). (2000)

Aoki K.：“GroEL 通过随机序列结合人造蛋白质”J.Biol.Chem..（正在出版）。

Shiseki,K.: "Synchronized Domain Opening Motion of GroEL is Essential for Communication between the Two Rings."J.Biol.Chem.. 276(In press). (2001)

Shiseki,K.：“GroEL 的同步域打开运动对于两个环之间的通信至关重要。”J.Biol.Chem.. 276（印刷中）。

田口英樹(分担): "シャペロニンとGFPフォールディング"生物工学会誌. 3 (2000)

田口秀树（撰稿人）：“Chaperonin 和 GFP 折叠”日本生物工程学会杂志 3（2000 年）。