肝细胞核因子4诱导肝星状细胞分化移植治疗终末期肝病

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    81070359
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    32.0万
  • 负责人：
    杨家和
  • 依托单位：
    中国人民解放军第二军医大学
  • 学科分类：
    H0311.肝保护和人工肝
  • 结题年份：
    2013
  • 批准年份：
    2010
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2011-01-01 至2013-12-31

项目摘要

调控干细胞重要分化基因表达，是诱导定向分化肝细胞并维持生物学功能的重要方法之一，将为肝细胞移植技术提供新型的供体来源。近期研究表明肝星状细胞（HSC）是一种肝内干细胞，对肝脏发育损伤修复具有重要作用。肝细胞核因子家族（HNF）中HNF4α是促进肝细胞分化和维护其生物学功能的重要转录蛋白。本课题前期工作发现，HNF4α能够诱导HSC向肝细胞形态转变。在此基础上，我们将利用腺病毒载体上调HSC中HNF4α的表达，诱导HSC向成熟肝细胞分化，有效提高肝细胞的营养、代谢和解毒功能，同时系统探讨HNF4诱导干细胞分化的机制。进一步将供体肝细胞经脾脏注射移植于急性肝功能衰竭动物模型，评估治疗后肝功能改善和肝组织修复情况，终末期肝病采用细胞移植技术治疗提供新的临床思路。

结项摘要

首先克隆HNF4α基因cDNA片段，利用AdEasy腺病毒构建系统，将HNF4α基因cDNA片段外源插入病毒载体巨细胞病毒启动子（CMV）下游，构建高效表达HNF4α的重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α，胶原酶两步灌注法分离原代大鼠HSC，Nycodenz梯度离心纯化，然后进行原代培养。利用AdHNF4α将HNF4α基因导入原代HSC，观察HNF4α基因表达对HSC向肝细胞定向分化能力以及生物学功能的影响。. 一、构建重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α. 根据人HNF4α cDNA序列设计、合成引物，进行PCR体外扩增，回收大小为1425 bp的DNA片段，用EcoRⅤ和BglⅡ酶切后装入穿梭质粒pAdTrack-CMV，得到pAdTrack-CMV-HNF4α，进行测序，确保HNF4α基因扩增正确。将pAdTrack-CMV-HNF4α应用内切酶PmeⅠ酶切回收线性化pAdTrack-CMV-HNF4α,电穿孔共转化感受态BJ5183细菌,抽提质粒，测序鉴定。在293细胞包装、扩增腺病毒AdHNF4α和AdGFP，通过氯化铯梯度离心法纯化病毒，用TCID50方法测得重组腺病毒AdHNF4α滴度达到1×10(10) pfu/ml；AdGFP滴度达到3×10(10) pfu/ml。. 二、腺病毒AdHNF4α诱导原代大鼠肝星状细胞分化. 应用改良的胶原酶两步法分离培养原代大鼠HSC，平均每只大鼠可获得1.5×10(7)个HSC 。将分离原代大鼠HSC立即抽提RNA，逆转为cDNA后，PCR检测干细胞标志物CD133、GFAP、nestin、CD105，在mRNA水平，原代大鼠HSC表达上述基因。AdGFP或AdHNF4α分别以MOI 50感染大原代鼠肝星状细胞，动态观察细胞形态变化；收集感染后72 h细胞，抽提总RNA和蛋白。 RT-PCR法检测发现AdHNF4α组Ⅰ型胶原、α-SMA、TIMP-1、Vimentin基因 mRNA水平表达均较AdGFP组明显减少；上皮表型基因E-cadherin表达明显增加（P<0.05）；肝细胞功能基因GS、PEPCK mRNA表达水平表达水平明显增强（P<0.05）；可以检测出AFP、ALB的表达

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Twist2 is a valuable prognostic biomarker for colorectal cancer
Twist2 是结直肠癌有价值的预后生物标志物
  • DOI：
    10.3748/wjg.v19.i15.2404
  • 发表时间：
    2013-04-21
  • 期刊：
    WORLD JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY
  • 影响因子：
    4.3
  • 作者：
    Yu, Hao;Jin, Guang-Zhi;Yang, Jia-He
  • 通讯作者：
    Yang, Jia-He
Asparagine synthetase is an independent predictor of surgical survival and a potential therapeutic target in hepatocellular carcinoma.
天冬酰胺合成酶是手术存活的独立预测因子，也是肝细胞癌的潜在治疗靶点
  • DOI：
    10.1038/bjc.2013.293
  • 发表时间：
    2013-07-09
  • 期刊：
    British journal of cancer
  • 影响因子：
    8.8
  • 作者：
    Zhang B;Dong LW;Tan YX;Zhang J;Pan YF;Yang C;Li MH;Ding ZW;Liu LJ;Jiang TY;Yang JH;Wang HY
  • 通讯作者：
    Wang HY

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其他文献

Galectin-4蛋白在肝细胞癌中特异性高表达
  • DOI：
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  • 发表时间：
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  • 期刊：
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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    丛文铭
转化生长因子β1在肝纤维化发生发展中的作用及其靶向干预策略
  • DOI：
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  • 发表时间：
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  • 期刊：
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  • 影响因子：
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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    杨家和
人硫酸酯酶1基因的作用机制及抗瘤活性
  • DOI：
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  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    临床肿瘤学杂志
  • 影响因子：
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  • 作者：
    杨家和
  • 通讯作者：
    杨家和
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腺病毒表达的preS2抗体抑制乙型肝炎病毒感染和肝癌发生
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    World J Gastroenterology
  • 影响因子：
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  • 作者：
    杨家和
  • 通讯作者：
    杨家和
肝星状细胞与肿瘤肝转移的研究进展
  • DOI：
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  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    临床肿瘤学杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    刘虎;杨家和;苏长青
  • 通讯作者：
    苏长青

其他文献

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杨家和的其他基金

空壳腺病毒携带全长HBV表面前S2蛋白抗体基因治疗乙肝预防肝癌的研究
  • 批准号：
    30872998
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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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