IFN-τ调控牛囊胚发育的分子通路

本项目将以牛体外受精胚胎为材料，首先用RT-PCR技术检测不同发育阶段胚胎的IFNTR表达规律，确定培养液中添加IFN-τ的理想时间，通过观察早期胚胎发育效果，确定添加浓度；然后，提取处理组与对照组囊胚mRNA,进行深度测序，对其结果进行聚类分析，筛选受IFN-τ调控的候选基因；再利用RT-PCR、胚胎免疫荧光和Western Blot检测并验证候选基因的表达水平，进一步筛选调控胚胎发育的关键基因；最后，利用细胞信号通路特异性抑制剂或RNA干涉技术进行进一步验证关键基因的功能，确定IFN-τ调控牛囊胚发育的分子通路。研究结果将揭示I型干扰素与牛早期胚胎发育的分子联系，丰富哺乳动物胚胎发育理论，为提高反刍动物早期胚胎体外发育效率技术的研发提供新的理论依据。同时，也可能发现IFN-τ的新功能，不仅丰富I型干扰素对细胞增殖或凋亡的调控理论，而且也可能为干扰素治疗人类或动物疾病提供新的线索。

本项目深入研究了IFN-τ调控反刍动物早期胚胎发育的分子机制。课题组最先发现干扰素受体基因IFNAR1在第15 d和20d的绵羊胚胎滋养外胚层细胞中表达，外源IFN-τ能诱导绵羊滋养细胞系中ISG15 , OAS1 和 BST2基因的表达，并可能通过上调CTCF基因表达而促进细胞增殖，在培养液中添加100 ng/ml 的rbIFN-τ显著增加牛孤雌激活和体外受精的囊胚率和囊胚细胞数。深入研究发现IFNAR1和IFNAR2基因在第4到 8 d 的牛体外受精胚胎上均有表达，外源IFN-τ通过上调connexin43、E-cadherin、GM-CSF和IGFII基因表达促进牛体外受精胚胎的发育。这表明IFN-τ可以通过其受体以自分泌方式调控反刍动物早期胚胎的发育。由于ISG15是干扰素诱导表达的主要产物， 课题组通过慢病毒干扰载体敲降其表达来探索干扰素调控胚胎发育的分子通路。结果显示敲降ISG15 可以显著降低胚胎孵化率、囊胚直径和平均囊胚直径细胞数，同时抑制牛囊胚中IFN-τ、Ets2的 mRNA和 Connexin43蛋白表达。这说明IFN-τ是通过诱导ISG15表达来促进早期胚胎发育。与此同时，课题组建立了牛孵化囊胚的藻酸盐胶3D培养体系，最长可以将牛IVF孵化囊胚在体外培养32天。胚胎在此体系中不仅形态伸长、细胞数增加，而且还出现双核细胞等表型，且IFN-τ和ISG15 mRNA在第26和第32天牛胚胎中仍有表达。这为深入研究反刍动物胚胎伸长和附植机制提供了理想的体外模型。此外，为确认IFN-τ在早期妊娠诊断上所发挥的作用，课题组采集AI后17～20d的荷斯坦母牛血液，分离PBMCs，检测UBE1L、UBCH8 和ISG15基因表达水平，结果表明这三个基因在妊娠母牛中明显升高。这暗示它们可以作为牛早期妊娠诊断的候选因子。以上结果对提高牛胚胎体外生产效率和降低体内胚胎早期死亡有重要应用价值，也为深入探讨附植前后牛胚胎发育的分子机制提供了很好的平台。在此课题资助下，已发表SCI论文5篇，获得国家发明专利授权1项，培养5名博士研究生和 2名硕士研究生。

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