猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL磷酸化修饰位点的变化规律及主要调控路径

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31672419
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    64.0万
  • 负责人：
    曾申明
  • 依托单位：
    中国农业大学
  • 学科分类：
    C1704.畜禽繁殖学
  • 结题年份：
    2020
  • 批准年份：
    2016
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2017-01-01 至2020-12-31

项目摘要

This project will focus on phosphorylated modifications of BimEL in porcine granulosa cells during follicular atresia and their regulating pathways. Firstly, phosphorylation sites of BimEL in porcine follicular granulosa cells from healthy, slightly atretic and atretic follicles with the same diameters will be analyzed by LC MS/MS respectively to find different phosphorylated sites, and their upstream molecular pathways will be predicted by bioinformatics methods. Then, overexpressions of wild-type and different phosphomutant BimEL will be performed in bim-/- porcine fetus fibroblast cells and bim-/- COV434 cells to determine their functions in cell survival, proliferation and apoptosis. Based on the above results, the specific antibodies to functional phosphorylated BimEL will be prepared. Next, RNAi, Western blot assay, signaling pathway activators and inhibitors will be used to decipher molecular pathways regulating different BimEL phosphorylations in the above bim-/- cells, which will be further confirmed in in-vitro cultured follicles treated by FSH, IGF-1 or heat stress. Finally, immunohistochemistry detection and Western blot assay will be carried out to validate the relationship between follicle health status and expressions of different phosphorylated BimEL in granulosa cells from ovarian tissues. The results are anticipated to elucidate the physiological functions of BimEL phosphorylations during follicular development, and may provide novel targets for new drugs and techniques designs to control follicular development in mammals.
本项目将探索猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL磷酸化位点的变化规律及其调控机制。首先，用飞行质谱技术分别检测相同直径健康、轻度闭锁和闭锁卵泡中颗粒细胞内BimEL的磷酸化位点，经生物信息学比对，筛选差异位点，并预测其功能和上游调控机制。然后，在bim-/-猪胎儿成纤维细胞和人COV434细胞中，通过BimEL超表达和点突变，结合细胞凋亡与增殖检测技术，确定具有生物学功能的磷酸化位点，并制备相应抗体。再以bim-/-细胞为材料，运用Western blot和RNAi技术，结合细胞通路调控剂，解析引起不同磷酸化修饰的分子路径，并在FSH、IGF-1和热应激处理卵泡中确认。最后，运用免疫组化和Western blot技术验证卵巢颗粒细胞中不同磷酸化修饰BimEL水平与卵泡健康状态的关系。研究结果将明确BimEL磷酸化修饰在卵泡发育中的功能，为家畜卵泡发育调控技术或药物研发提供新的理论依据。

结项摘要

本课题探索了猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL关键磷酸化修饰位点变化及其调控通路。研究发现，猪卵泡颗粒细胞中BimEL磷酸化修饰模式和水平与闭锁状态密切相关。FSH、IGF-1通过激活ERK通路上调p-BimEL-S65水平，加剧BimEL降解，促进颗粒细胞存活和卵泡发育，同时褪黑素通过上调磷酸化BimEL的泛素化降解参与卵泡健康状态的维持。相反，环境热应激通过激活JNK通路上调p-BimEL-T112水平，诱导生长卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。另外，课题组用LC-MS/MS技术全面分析了猪卵泡从健康、轻度闭锁到闭锁过程中颗粒细胞中蛋白质和蛋白质磷酸化修饰的变化。总共鉴定到了7104种蛋白质，其中6201种被定量分析，与闭锁卵泡相比，健康卵泡中有29种上调、21种下调，且差异倍数在5以上；鉴定到2830种蛋白质的6839个磷酸化位点，定量了其中1760种的4723个磷酸化位点，与闭锁卵泡相比，健康卵泡中39个位点上调、26个下调，且差异倍数在7以上。通过GO功能聚类和KEGG通路分析，发现了诱发颗粒细胞凋亡的主要功能蛋白质、关键磷酸化位点、主要生化过程和重点调控通路，并从转录因子和蛋白激酶角度对关键通路作了深入分析。同时，对MIF（巨噬细胞迁移抑制因子）在猪卵泡细胞中的分布和p-caspase6-S76磷酸化位点在细胞凋亡中的功能进行了深入研究。课题组首次从关键促凋亡蛋白的磷酸化修饰角度对动物卵泡的闭锁机制进行了诠释，同时，建立了哺乳动物卵泡闭锁过程中颗粒细胞的蛋白质变化数据库和蛋白质互作全景图。这不仅为动物卵泡闭锁机制的后续探索提供了蛋白质数据平台，也为卵泡体外培养、辅助生殖、人类卵巢早衰和生育力保存等技术的研发提供明确的理论指导。相关研究结果已SCI期刊发表研究论文6篇，其中3篇影响因子大于5.0；在本课题资助下4名硕士生和3名博士生完成了学位论文；有关IGF-1和MIF的研究结果正在向动物生产和人类妇产科临床进行转化研究。

项目成果

期刊论文数量（6）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Conserved microRNA mediates heating tolerance in germ cells versus surrounding somatic cells
保守的 microRNA 介导生殖细胞与周围体细胞的耐热性
  • DOI：
    10.1080/15476286.2019.1639311
  • 发表时间：
    2019-07
  • 期刊：
    RNA Biology
  • 影响因子：
    4.1
  • 作者：
    Wu Yi;Wang Yingzheng;Liu Qiang;Zhu Lihua Julie;Gao Hui;Cui Maosheng;Liu Jinghao;Zhao Pengju;LiU Jianfeng;Chen Lei;Wang Jinyong;Zeng Wenxian;Woodruf Teresa K.;Zeng Shenming
  • 通讯作者：
    Zeng Shenming
IGF-1 Inhibits Apoptosis of Porcine Primary Granulosa Cell by Targeting Degradation of BimEL
IGF-1 通过靶向降解 Bim(EL) 抑制猪原代颗粒细胞凋亡
  • DOI：
    10.3390/ijms20215356
  • 发表时间：
    2019-11-01
  • 期刊：
    INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES
  • 影响因子：
    5.6
  • 作者：
    Han, Ying;Wang, Shumin;Zeng, Shenming
  • 通讯作者：
    Zeng, Shenming
Insulin mitigates apoptosis of porcine follicular granulosa cells by downregulating BimEL
胰岛素通过下调 BimEL 减轻猪滤泡颗粒细胞凋亡
  • DOI：
    10.1016/j.repbio.2019.08.003
  • 发表时间：
    2019-09-01
  • 期刊：
    REPRODUCTIVE BIOLOGY
  • 影响因子：
    2.1
  • 作者：
    Han, Ying;Wang, Shumin;Zeng, Shenming
  • 通讯作者：
    Zeng, Shenming
Integrative Proteomic and Phosphoproteomic Analyses of Granulosa Cells During Follicular Atresia in Porcine.
猪滤泡闭锁期间颗粒细胞的综合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析
  • DOI：
    10.3389/fcell.2020.624985
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    Frontiers in cell and developmental biology
  • 影响因子：
    5.5
  • 作者：
    Yang F;Liu Q;Chen Y;Ye H;Wang H;Zeng S
  • 通讯作者：
    Zeng S
Dynamics and Regulations of BimEL Ser65 and Thr112 Phosphorylation in Porcine Granulosa Cells during Follicular Atresia
猪卵泡闭锁过程中猪颗粒细胞 BimEL Ser65 和 Thr112 磷酸化的动态和调控
  • DOI：
    10.3390/cells9020402
  • 发表时间：
    2020-02-01
  • 期刊：
    CELLS
  • 影响因子：
    6
  • 作者：
    Yang, Feng;Chen, Yanhong;Zeng, Shenming
  • 通讯作者：
    Zeng, Shenming

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其他文献

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曾申明的其他基金

FSH通过BimEL调控猪卵泡自噬的分子机制
  • 批准号：
    31470077
  • 批准年份：
    2014
  • 资助金额：
    88.0 万元
  • 项目类别：
    面上项目
IFN-τ调控牛囊胚发育的分子通路
  • 批准号：
    31172209
  • 批准年份：
    2011
  • 资助金额：
    60.0 万元
  • 项目类别：
    面上项目
FSH抑制猪颗粒细胞中促凋亡蛋白Bim表达的分子机制
  • 批准号：
    31072031
  • 批准年份：
    2010
  • 资助金额：
    33.0 万元
  • 项目类别：
    面上项目
钙振荡对猪体外成熟卵子凋亡的分子调控分析
  • 批准号：
    30571333
  • 批准年份：
    2005
  • 资助金额：
    25.0 万元
  • 项目类别：
    面上项目
体外操作对牛胚胎IFN-t基因活性影响的研究
  • 批准号：
    30100133
  • 批准年份：
    2001
  • 资助金额：
    17.0 万元
  • 项目类别：
    青年科学基金项目

相似国自然基金

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AI项目解读示例

课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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