人源化肌肉嵌合Duchenne型肌营养不良症模型鼠的建立及CRISPR/Cas9编辑模型鼠缺陷基因并恢复dystrophin长期表达的研究

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a deadly X-linked recessive hereditary disease, which caused by the deficiency of dystrophin arising from mutations of DMD gene. Nowadays, gene therapy is the hotspot for the research of DMD. CRISPR/Cas9 could edit gene defects permanently, and have made progress on mdx mice. But if CRISPR/Cas9 could edit human DMD gene in vivo and restore dystrophin was still unknown. Our previous studies indicated that human-derived MDSCs could differentiate into muscle cells in mice. So we assumed that if we transplant DMD patients’ MDSCs to immunodeficient mice, build a humanized muscle-chimeric DMD model mice, and treat the model mice with AAV- CRISPR/Cas9. It is likely to restore dystrophin and function persistently in DMD derived muscle cells. Meanwhile, we could explore the mechanism, efficiency and security of CRISPR/Cas9 in DMD gene editing in vivo. This project could provide important basis for CRISPR/Cas9 in DMD clinical therapy.

Duchenne型肌营养不良症（DMD）是一种致死性肌萎缩的X连锁隐性遗传病，由DMD基因突变导致抗肌萎缩蛋白（dystrophin）缺失而致病。基因治疗是目前研究热点。近年兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术可永久地编辑基因缺陷，并在DMD模型鼠的治疗取得了进展。但由于种属差异，是否能在体内有效编辑人的DMD基因，持续表达dystrophin尚不清楚。我们前期研究表明：人肌源性干细胞可在小鼠体内成肌分化，并长期嵌合生长。我们设想：如果将DMD患者的肌源性干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，构建人源化肌肉嵌合DMD模型鼠，再以腺相关病毒为载体的CRISPR/Cas9治疗模型鼠，极有可能使来自DMD患者的肌细胞的dystrophin能长期持续表达，肌细胞功能恢复。与此同时探讨CRISPR/Cas9体内编辑DMD的机制、效率和安全性。为CRISPR/Cas9治疗DMD的临床应用，提供重要的依据。

背景.抗肌萎缩蛋白（dystrophin）是维持肌细胞骨架的一种关键结构蛋白，编码它的DMD基因的突变会导致Duchenne型肌营养不良症(DMD)，这是最常见的一种致命性遗传疾病，目前尚无有效治疗方法。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)介导的基因编辑是一种有前途的永久性治疗DMD的策略。.方法.在本研究中，我们开发了一种新的策略，以CRISPR介导的外显子46-54的大片段删除来重构DMD突变。通过使用DMD患者来源的肌源性干细胞(DMD- MDSCs)，我们将这种方法与其他DMD修复策略进行了比较。此外，通过将DMD- MDSCs移植到免疫缺陷小鼠体内，建立了患者来源移植物(PDX) DMD小鼠模型。采用腺相关病毒载体将CRISPR基因编辑成分肌肉注射治疗PDX DMD小鼠模型。.结果.结果表明，大片段删除突变DMD外显子对恢复dystrophin表达具有较高的效率。我们还证实了来自Prevotella和Francisella 1(Cas12a)的CRISPR介导的基因组编辑可以和CRISPR相关蛋白9 (Cas9)一样有效地纠正DMD突变。另外，经大片段删除后，PDX DMD小鼠模型中有超过10%的人DMD肌纤维表达dystrophin。体内恢复的肌营养不良糖蛋白复合物组分β-肌营养不良聚糖（β-dystroglycan）的表达证明了其功能。.结论.我们在PDX DMD小鼠模型中证实了临床相关的CRISPR/Cas9能够在体内恢复人肌细胞中dystrophin表达。本研究也为基因治疗其他遗传病提供了一种方法。

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