一种乙酸氧化菌的单细胞基因组研究

在许多特殊的厌氧环境中存在一类乙酸氧化菌，它们与氢营养型甲烷菌互生、将乙酸转化为氢气与二氧化碳。目前只有四株这类乙酸氧化菌得到过纯培养，对这四株菌的初步研究表明，它们的生理生化特性及系统发育地位具有较大的多样性。目前由于缺少这类菌的基因组信息，尚无法了解它们在乙酸氧化代谢途径上的共性和特异性。本项目将从一个具有乙酸氧化产氢功能的混合培养物出发，利用流式细胞仪分选和多重置换全基因组扩增技术，获得乙酸氧化菌单细胞的全基因组DNA，分析基因组序列并注释其功能基因，解析其氧化乙酸产氢的代谢途径及关键酶基因。并通过RT-PCR监测这些基因在混合培养物氧化乙酸过程中的表达水平，验证其功能。研究结果不仅为更好地认识乙酸氧化菌的遗传特性积累基础数据，也为进一步分析环境中同类型乙酸氧化菌的生态学特性提供参考基因组或分子标记。对氧化乙酸产氢代谢途径的解析，也将为开发底物全程利用的产氢技术提供新思路。

乙酸氧化菌是一类与氢营养型甲烷菌互生，并将乙酸降解为H2和CO2的微生物。Clostridium ultunense是很多厌氧甲烷发酵群落中优势的乙酸氧化菌，由于缺少基因组信息，人们对该菌的乙酸氧化代谢途径了解较少，还原型的Wood-Ljungdahl途径被认为是最有可能的乙酸氧化代谢途径。为了获得乙酸氧化菌的基因组，我们从厌氧沼液发酵微生物群落出发，经过2年的富集培养，获得了一个乙酸氧化菌占优势的微生物群落BM，并进行了元基因组测序。序列拼接后，获得了三个属于C. ultunense的基因组cult1，cult2和cult3，这些基因组完整度约80%。同时，我们还对C. ultunense BS菌株进行了基因组测序，获得了它的基因组草图。为了解析乙酸氧化代谢途径，我们对5株C. ultunense（包括三个cult1， cult2和cult3，以及2个分离菌株BS和ESP）进行了分析。我们发现Wood-Ljungdahl代谢途径在5个菌株中均缺乏三个酶，这证明该菌利用Wood-Ljungdahl代谢途径进行乙酸氧化的假说是不完全正确的。我们进一步分析后发现，C. ultunense基因组中存在乙酸激酶，磷酸乙酰转移酶和丙酮酸铁氧还原酶可以将乙酸转化为丙酮酸，同时还存在完整的丙酮酸-丝氨酸-甘氨酸合成途径，可以将丙酮酸转化为亚甲基四氢叶酸；然后再由部分Wood–Ljungdahl代谢途径将亚甲基四氢叶酸氧化为CO2并生成NADH（可以用于产氢）。我们还同时分析了5个菌株基因组中与逆向电子传递系统相关的基因，结果表明其可能利用Rnf复合体,歧化氢酶和NADH醌还原酶三种机制进行逆向电子传递。乙酸氧化菌cult1，cult2和cult3的转录组分析表明与乙酸氧化有关的基因均进行了转录，进一步验证了我们提出来的这条乙酸氧化代谢途径的正确性。显然，C. ultunense将氨基酸合成途径（丙酮酸-丝氨酸-甘氨酸代谢途径）与部分的Wood–Ljungdahl代谢途径进行了优化组合，形成了其独特的乙酸氧化代谢途径。这些参与乙酸氧化的基因不成簇存在且周围没有转座子，表明这些基因不是通过水平转移获得的，泛基因组学分析进一步说明了乙酸氧化代谢途径形成的过程。解析乙酸氧化的代谢途径，有助于我们提高厌氧沼气发酵系统的产气效率和稳定性，并用于建立全程底物利用的产氢体系。

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