新的核基因分子标记筛选与龟鳖类动物的系统位置研究

近年来，为克服基因树与物种树不一致的问题，分子系统学的研究趋势是努力使用更多的、来自核基因组不同位置、具有不同进化历史的分子标记，构建海量信息的大数据集进行系统发育分析。龟鳖类动物在爬行动物中的系统地位是我们了解早期爬行动物为适应缺水陆地环境而发生适应性进化过程的关键，也是分子系统学与传统形态学研究争论的主要问题之一。然而适用于爬行动物的主要支系的核基因分子标记还比较少，阻碍了对爬行动物主要类群分子亲缘关系研究的深入开展。因此，如何快速大量获得适用于爬行动物系统发育分析的新的核基因标记，正成为一个非常有意义的研究课题。本项目拟通过对爬行动物姐妹类群的基因组数据的同源比较分析，用生物信息学的方法从基因组比对数据中大规模筛选新的核基因标记，用于研究龟鳖类动物的系统发育位置这一关键进化问题，揭示形态学与分子系统学结论产生矛盾的原因，同时也为陆生脊椎动物分子系统学研究提供更多的候选分子标记。

随着分子系统学研究的不断深入，基于多基因大数据集的系统发育基因组学（Phylogenomics）已经成为现代分子系统学研究领域的热点。在两栖爬行动物方面，由于缺乏足够数量的核基因分子标记，系统发育基因组学研究进展一直比较缓慢。为此，在本项目的支持下，我们巧妙地对UCSC 基因组分析平台上的多物种基因组比对(Multiple Genome Alignments)数据源进行生物信息学开发，编写了一套比较基因组学分子标记开发软件，能够在基因组水平上对各类生物的分子标记进行高通量筛选。我们将这一方法应用于两栖爬行动物系统学研究中，试验性地筛选了21 个新的核基因标记，将两栖爬行动物的分子系统学研究推进到了基因组水平；同时，证明了龟鳖类动物与初龙类（鸟+鳄）为姐妹群关系，要可靠得到这一结果需要13KB 以上的数据规模，之前各种分子系统学研究得出的矛盾结果是由于数据量不足导致的，相关研究成果2011 年6 月发表在进化生物学国际著名杂志Molecular Biology & Evolution 上。我们的这一研究在分析速度与标记实验成功率上都远远领先于之前的基于双物种比对的开发策略，并解决了龟鳖类系统位置这一陆生脊椎动物进化上争议已久的重要进化问题。. 针对目前脊椎动物分子系统学中缺少通用性好、分辨率高的核基因标记的现状，我们开发了三个通用的长片段NPCL标记(每个都大于1.6kb)，并且它们的进化速率能够适用于20~420百万年分歧时间的类群。我们还将更为灵敏的巢式PCR方法引入到分子系统学的实验手段中，提出了借助巢式PCR策略来发展广泛应用于脊椎动物的NPCL分子标记的研究思路。我们的研究表明，与广泛使用的RAG1基因相比，我们开发的三个新的长片段核基因标记SACS、KIAA1239和TTN具有类似或更好的系统发育解析能力；在PCR扩增成功率和效率上，巢式PCR方法较传统的双引物PCR法有显著性的优势。该结果2012年发表在PLoS ONE杂志上。. 另外，在本项目的支持下，我们还额外开展了两栖爬行动物Hox基因簇的进化分析、蛇类红外视力相关基因TRPA1的分子进化的相关研究，两项研究分别在BMC Evol Biol和PLoS ONE杂志上发表论文一篇。本项目圆满完成了项目设定的各项目标，共发表SCI论文4篇。

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