猪流行性腹泻病毒nsp7拮抗IFN-β产生及其信号转导的分子机制

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is an important porcine enteropathogenic coronavirus which causes lethal watery diarrhea in piglets and results in high economic losses. Previous studies have demonstrated that PEDV infection inhibits interferon (IFN) production to promote its proliferation. In our preliminary experiments, we found that the nsp7, a nonstructural protein encoded by PEDV, inhibits RIG-I-mediated IFN-β production and IFN-β-induced expression of IFN-stimulated gene (ISGs), indicating that PEDV nsp7 can antagonize both IFN-β production pathway and IFN-β signaling transduction pathway. However, the mechanism(s) utilized by nsp7 to do so remain elusive. Based on these preliminary findings, here we plan to identify the targets of nsp7, by investigating interaction between the components of RIG-I signal pathway and nsp7, and by analyzing the role of nsp7 to the phosphorylation and nuclear translocation of molecules of JAK-STAT signal pathway and the assembly of STAT1/STAT2/IRF9 complex. Furthermore, we will identify the possible function domain(s) or key amino acid site(s) of nsp7 responsible for its IFN inhibitory property. By using the infectious clone and reverse-genetic system of PEDV, recombinant PEDV with mutants in the possible function domain(s) or key amino acid site(s) of nsp7 will be constructed to analyze the immune regulation function of nsp7 under virus infection condition.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是危害当前养猪业的重要肠道冠状病毒。PEDV感染后可通过抑制干扰素(IFN)产生促进自身增殖并致病。我们的前期研究发现，PEDV编码的非结构蛋白nsp7既能拮抗RIG-I介导的IFN-β产生，又能抑制IFN-β诱导的干扰素刺激基因(ISGs)的表达，提示nsp7可同时靶向IFN-β产生和信号转导这两个紧密联系的过程，但其作用机制尚不清楚。本项目拟进一步探讨nsp7与RIG-I信号通路中各种信号分子的相互作用，分析nsp7对JAK-STAT信号通路中信号分子的磷酸化、核转运以及STAT1/STAT2/IRF9复合物形成的影响，确定nsp7的作用靶点；同时，挖掘nsp7拮抗IFN-β产生及其信号转导的功能域或关键氨基酸位点，并借助感染性克隆与反向遗传操作系统从病毒水平进一步分析这些氨基酸位点在PEDV拮抗IFN-β中的作用，更深入地揭示nsp7的免疫抑制功能。

猪流行性腹泻（PED）是危害养猪业的重要疫病，主要引起新生仔猪的腹泻、脱水或死亡。干扰素（IFN）反应是宿主抗病毒感染的重要防御机制，但病毒往往进化出各种策略拮抗宿主IFN的抗病毒作用。nsp7是冠状病毒复制酶复合体的重要组成，在病毒复制和免疫调节中发挥重要作用。本项目针对PEDV nsp7调控IFN的分子机制进行了深入的研究。分析了多种猪源细胞系对PEDV的易感性，发现猪回肠上皮细胞IPI-2I对PEDV有一定的易感性；通过克隆，获得一株对PEDV高度易感的细胞克隆株IPI-FX。构建了PEDV变异毒株AJ1102的感染性克隆，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了一种简便、快速构建PEDV重组病毒的新方法，相对于传统方法，该方法具有靶点选择宽泛、特异性强、操作简单、效率高和实验周期短等优点，可以在一周内获得重组病毒。对全球409株PEDV全基因组序列分析发现现有的PEDV可分为GI-a、GI-b、GII-a、GII-b、GII-c 5个亚群，GII-c亚群病毒是由病毒重组进化而来。利用双荧光素酶系统检测证实nsp7拮抗仙台病毒（SeV）诱导的IFN-β产生以及转录因子IRF3和NF-κB激活，进一步分析发现PEDV nsp7靶向RLR信号通路中的模式识别受体RIG-I拮抗IFN-β产生。对PEDV nsp7拮抗I型IFN信号转导的机制研究发现，PEDV nsp7与STAT1/STAT2存在相互作用，阻碍核转运蛋白KPNA1对STAT1的识别，从而抑制ISGF3复合物（STAT1/STAT2/IRF9）入核，导致I型IFN信号转导受阻。本项目还发现PEDV nsp7以二聚体的形式存在，其与nsp8存在相互作用，但其拮抗I型IFN信号转导与nsp8无关。另外，全面鉴定了PEDV的另外一种具有拮抗I型IFN的蛋白酶（3C-like蛋白酶）活性的关键氨基酸位点。上述研究结果不仅从分子水平上阐明了PEDV蛋白酶调控宿主抗病毒天然免疫的机制，而且为PEDV新型疫苗开发和药物设计奠定了基础。项目执行期内先后在FASEB Journal、Transboundary and Emerging Diseases、Veterinary Microbiology等杂志发表研究论文5篇，申报国家发明专利5项，培养博士研究生5名、硕士研究生2名。

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