α-抗肌萎缩相关糖蛋白病α-DG的氧位糖基化基因突变分析与功能研究

Dystroglycanopathy is a group of muscular dystrophies with a reduction in α-dystroglycan (α-DG)' ligand-binding capacity resulting from its aberrant O-glycosylation, which has clinical and genetic heterogeneity, manifested with muscular dystrophy, brain and eye abnormalities. The exact glycan synthesis and modification pathways involved, as well as their role in ligand binding, remain only partially characterized. Among them, the function of Fukuyama type congenital muscular dystrophy(FCMD)'s gene product-fukutin, remains unknown. Under the previous grant of National Natural Science Foundation of China(30600683), we have demonstrated that fukutin forms a complex with muscle-eye-brain disease's gene product-O-linked mannose ?1, 2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 (POMGnT1) and may modulate its enzymatic activity, as well as diagnosed a lot of such kind of Chinese patients based on molelular pathology and gene mutation analysis. We firstly report FCMD patient out side of Japan in the world. Based on the early work of identifying loss of enzyme activity and mislocalization of POMGnT1 protein by novel disease-causing mutation in Chinese patient, this project plans to do gene mutation analysis in our α-dystroglycanopathy patients continually. At the same time, to assay the enzyme activity from cultured patient's skin fibroblast and analysis of glycan of α-DG. To observe the subcellular localization and enzyme activity change and the relationship between fukutin and the mutant type POMGnT1 in order to investigate their interaction and influence to α-DG ligand-binding activity. This can not only provide some clues to the pathogenesis of α-dystroglycanopathy, but also develop some new path to the therapy.

α-抗肌萎缩相关糖蛋白病表现为肌营养不良、脑和眼发育畸形，存在α-DG蛋白的糖基化缺陷，具临床和遗传异质性，严重影响儿童发育，具体发病机制不清。在前基金(30600683)支持下我们证实其中的福山型先天性肌营养不良(FCMD)的基因产物fukutin与肌-眼-脑病的基因产物POMGnT1形成复合体并调节其酶活性，推测fukutin可能起分子伴侣作用，并对该类疾病行分子病理及基因诊断，在国际上首次报道日本以外FCMD。在前期证实中国患儿POMGnT1基因新突变、突变体酶活性缺陷、在亚细胞内定位错误的基础上，本课题拟继续分析患儿α-DG的氧位糖基化基因，研究其皮肤成纤维细胞POMGnT1酶活性和α-DG糖链，利用转基因细胞模型观察突变体亚细胞定位、酶活性，探讨fukutin的调节作用及如何影响酶产物α-DG的糖基化和配体结合活性，这不仅为研究该类疾病的发病机制提供线索，对治疗也可能开辟新途径。

α-抗肌萎缩相关糖蛋白病是一类具有临床和遗传异质性的隐性遗传病，表现为肌营养不良、脑和眼发育畸形，均存在α-dystroglycan (α-DG) 的O-糖基化缺陷。但α-DG的糖链结构及相关糖基转移酶的功能未完全明确，α-抗肌萎缩相关糖蛋白病具体发病机制不清。基于我们的前期工作，α-抗肌萎缩相关糖蛋白病中的一种亚型——福山型先天性肌营养不良的基因产物fukutin与另一种亚型——肌-眼-脑病的基因产物糖基转移酶之一POMGnT1形成复合体定位于高尔基体，并调节其酶活性。我们提出fukutin可能起到分子伴侣作用的科学假设。由此，研究的主要内容是在前期发现中国患儿POMGnT1的新突变、证实突变体酶活性缺陷、在细胞内定位发生错误的基础上，分析α-抗肌萎缩相关糖蛋白病患儿的O-糖基化基因突变，检测培养的患者皮肤成纤维细胞和肌肉组织糖基转移酶活性和α-DG糖链，同时利用转基因细胞模型研究fukutin的分子伴侣作用。为了提高α-抗肌萎缩相关糖蛋白病的基因诊断检出率及诊断效率，我们自主设计肌病相关基因二代测序靶向捕获试剂盒 Sureselect，包括α-抗肌萎缩相关糖蛋白病相关18个致病基因在内的遗传性肌病Panel, 应用二代测序的方法，联合一代测序及本课题自主设计的二对特异性PCR引物同时扩增的方法筛查FTKN 3’非翻译区3kb的插入，我们一共基因确诊α-抗肌萎缩相关糖蛋白病41例。为18例患儿进行了肌活检组织冰冻切片常规病理和特异性抗体免疫组化染色，其中有11例患儿应用α-DG糖链抗体II-H6染色显示表达减少，提示糖链缺失，糖基化水平低下。为14例患儿建立皮肤成纤维细胞细胞系，对于POMT1基因突变的5例患儿，检测患儿皮肤成纤维细胞POMT酶活性发现患儿临床严重程度与POMT1酶活性呈反比。报道了12例FKRP突变导致的α-抗肌萎缩相关糖蛋白病患儿，说明FFRP突变在中国并不罕见，另外中国地区存在FKRP热点突变，通过单倍体型分析该热点突变为始祖突变。另外，通过转基因细胞模型提取蛋白进行免疫共沉淀，发现FKTN的表达产物fukutin与POMT2也存在相互作用，进一步提示了fukutin的分子伴侣作用。这不仅对研究该类疾病的发病机制提供线索，对治疗也可能开辟新途径。

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