Fukutin参与靶蛋白α-DG氧位糖基化作用的研究

Dystroglycanopathy is a group of muscular dystrophies with a reduction in α-dystroglycan (α-DG)’ ligand-binding capacity resulting from its aberrant O-glycosylation, which has clinical and genetic heterogeneity, manifested with muscular dystrophy, brain and eye abnormalities. The exact glycan synthesis and modification pathways involved, as well as their role in ligand binding, remain only partially characterized. Among them, the function of Fukuyama type congenital muscular dystrophy(FCMD)’s gene product-fukutin, remains unknown. Under the previous grants of National Natural Science Foundation of China (30600683，81271400), we firstly reported FCMD patient out side of Japan in the world.We have demonstrated that fukutin forms a complex with muscle-eye-brain disease’s gene product-O-linked mannose 1, 2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 (POMGnT1) and may modulate its enzymatic activity. So we speculate fukutin act as a chaparon function. We also confirmed another glycosyltransferase LARGE loclized on Glogi. Based on the early work, we want to use FCMD patient’s fibroblast, biopsied muscle and in vitro transgenic cell model, using immunofluorescence staining, co-immunoprecipitation and mass spectrometry analysis to study the relationship between fukutin and LARGE and whether fukutin modulates LARGE's enzyme activity or not, in order to investigate their interaction and influence to α-DG ligand-binding activity. This can not only provide some clues to the pathogenesis of α-dystroglycanopathy, but also develop some new path to the therapy.

α-DG病是α抗肌萎缩相关糖蛋白(α-DG)氧位糖基化缺陷所致的一组疾病，表现为肌营养不良和脑结构畸形，具临床和遗传异质性。在前基金支持下，我们发现α-DG病之一的福山型先天性肌营养不良(FCMD)的基因产物fukutin与靶蛋白α-DG氧位糖基化相关糖基转移酶之一POMGnT1形成复合体，并调节其酶活性，推测fukutin起分子伴侣作用，并证实另一α-DG病相关氧位糖基转移酶LARGE也定位于高尔基体。本课题拟利用FCMD患者皮肤成纤维细胞和肌活检组织标本以及体外转基因细胞模型，结合免疫荧光染色、免疫共沉淀和质谱分析等，研究fukutin与LARGE是否结合，是否对LARGE的酶活性具调节作用，由此探索fukutin影响酶产物α-DG氧位糖基化和配体结合活性的机制，揭示fukutin分子伴侣作用及其与α-DG氧位糖基化的关系。这不仅为研究该类疾病的发病机制提供线索，对治疗也可能开辟新途径

α-抗肌萎缩相关糖蛋白病（α-DGP）是一类具有临床和遗传异质性的隐性遗传病，表现为肌营养不良、脑和眼发育畸形，均存在α-dystroglycan(α-DG)的O-糖基化缺陷。但α-DG的糖链结构及相关糖基转移酶的功能未完全明确，α-抗肌萎缩相关糖蛋白病具体发病机制不清。在前期工作研究中，我们在国内首先报道了 α-DGP 中的 FKTN、POMGnT1、POMT1基因突变，并发现 fukutin不具有已知的糖基转移酶活性，突变的fukutin使POMGnT1发生细胞器移位，携带有FKTN基因反转录转座子插入的转基因小鼠模型POMGnT1酶活性降低30%，说明fukutin对POMGnT1的酶活性具有调节作用。突变的fukutin不仅自身的亚细胞定位错误，还可以造成POMGnT1的定位发生错误。进一步发现了fukutin通过跨膜结构域与POMGnT1结合，并且低温条件、姜黄素等可以纠正部分fukutin的错误定位。POMGNT1与FKTN突变导致的表型重叠以及二者导致α-DG缺陷的糖链具有相同的分子量，均提示fukutin与POMGnT1可能在同一酶通路上起作用。在此基础上，我门进一步收集α-DGP患者的临床资料及生物标本，以此探索α-DGP的分子遗传学机制，分别在体内体外实验中寻找与fukutin相互作用的蛋白，分析LARGE和FKTN基因编码产物的相互作用位点以及fukutin对LARGE功能的影响。在基金支持下，我们继续扩大α-DGP患者队列，收集诊断了国内最大样本量的α-DGP，到目前为止，临床诊断α-DG病146例，其中基因确诊56例，建立了完整的临床数据库和生物样本库，不断丰富中国α-DGP患者的基因型和表型谱，分析总结了不同类型的先天性肌营养不良临床和遗传学研究进展及相对应的患者临床表型特征等，在国际上首次进行单中心POMT1基因突变导致的α-DGP的基因型/表型分析及自然史研究，对影响预后的危险因素进行了分析。我们在国际上报道了大量的新致病突变，并发现中国FKRP突变相关α-DGP患者的热点突变。在基因产物功能研究上，初步发现fukutin可能与LARGE和POMT2也存在相互作用，通过免疫共沉淀及质谱技术初步发现POFUT2基因编码的O-连接糖基转移酶O-岩藻糖转移酶2与fukutin结合，但具体功能仍有待进一步研究。

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