应用微卫星DNA标记技术建立哺乳动物体内基因突变检测系统

化学药物致基因突变常常对使用者造成不可逆的伤害，虽然致突变检测的方法很多，但检出效率并不理想。本实验采用微卫星DNA标记技术对遗传背景为近交系的基因突变小鼠（如BALB/c裸鼠、BALB/c无毛鼠、白内障小鼠等）和基因修饰（转基因或基因敲除）动物的基因组进行多态性分析，并与同品系动物的基因组进行比较，筛选出多态性位点；进而应用筛选出的微卫星位点对经化学诱变剂（ENU）实施基因诱变的C57BL、BALB/c小鼠基因组DNA进行扩增，并与诱变前的本底基因组进行多态性比较，从中优化出微卫星位点组合；用该微卫星位点组合检测药物致基因突变，并与体外检测系统-Ames试验进行复核比较，初步建立哺乳动物体内药物致突变检测系统。该方法的建立为药物致突变检测提供了一种新的手段，将有效解决体内基因突变检测的难题，保证新药安全性评价真实可靠和维护人民的生命安全，并为基因突变性疾病的诊断提供依据。

化学药物致基因突变的副作用会对使用者造成不可逆的伤害，虽然化合物致基因突变的检测方法很多，但都存在一定的不足，尤其体内检测还没有真正意义上建立起来。鉴于此，我们设计了用微卫星（MS）DNA标记技术结合近交系动物建立化合物致突变哺乳动物体内检测方法。本课题从以下研究内容展开。①位点选择：从资料中检索获得多态性好的MS位点198个；②位点初筛：用这198个位点对5种自发突变近交系小鼠和6种近交系转基因小鼠基因组进行PCR扩增，采用STR扫描结合直接克隆测序分析，筛选出多态性位点41个；③位点优化：用筛选出的41个位点和1个偶然发现的多态位点对29种基因敲除近交系小鼠基因组进行多态性分析，结果有10个位点在11种基因敲除小鼠中呈现多态性；④位点进一步筛选和验证：应用化学诱变剂ENU、金属镉（Cd）和MNU（加2个位点）对C57BL/6J小鼠进行基因诱变，当出现病理损伤或肿瘤或表型变化后，采用筛选出的MS位点对其基因组进行多态性分析，以染毒前本底DNA作对照，结果出现多态性位点分别为4个、5个和3个。上述结果说明这44个位点组合可有效检出化合物致基因突变。在这44个位点经五种实验筛选和测试中发现，同时在3种实验中发生MSI的位点有5个；同时在2种实验中发生MSI的位点有9个。因此，有14个MS位点在2种以上实验筛选中出现了多态性。另外，在位点初筛实验中发现，某1个位点有2种动物出现多态性的有11个位点；有3种动物出现多态性的有6个位点。在基因敲除动物实验和MNU复核实验中分别各有2个位点在2种或2只小鼠中出现多态性。最后有21个MS位点在同一实验中有超过2种或2只动物出现了多态性。将上述14个MS位点和21个MS位点组合（共计35个），其中有8个位点同时满足两个条件，最终选出27个微卫星位点组合用于化合物致突变哺乳动物体内检测的位点组合；而8个位点外加3个在三种实验中均出现多态性的位点共11个位点作为核心微卫星位点组合。上述结果说明筛选出的MS位点组合可有效地检测出化合物致基因突变，可初步应用于药物致突变哺乳动物体内检测。这些实验结果都表明，我们利用MS技术结合近交系动物初步建立了哺乳动物体内化合物致突变检测系统，该方法的建立为化学药物致基因突变检测提供了一种新的手段，并为基因突变性疾病的诊断提供了依据，也为下一步开展化合物致基因突变检测试剂盒的研究奠定了基础。

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