常染色体显性视神经萎缩症相关蛋白OPA3的人源化突变小鼠模型建立及基因编辑治疗研究

Hereditary optic atrophy is one the most common inherited optic neuropathy, and typically affects young people. Although several genetic mutations have been identified in autosomal dominant optic atrophy patients, no mouse model has been generate to mimic the human mutation. G93S mutation (c.277 G-A) is one of the dominant causer mutation in patients. In this study we propose to use CRISPR system to generate OPA3 G93S mutant mice to compare with the human disorders. Moreover, the mutation will be test for correction through different strategies. Firstly, we will try to screen the sgRNA sequence to distinguish the mutant allele with wild-type allele to disrupt the pathogenic allele though subretinal injection of AAV-packaged Cas9/sgRNAs. Then, we will try to use the adenosine base editor (ABE) to correct the adenosine into guanosine. This study will provide a humanized mouse model for optic atrophy and new strategy for the gene therapy of this particular disease mutation.

遗传性视神经萎缩发病时间早，治疗极其困难，是眼科疾病治疗的难点。目前没有模拟人源突变的常染色体显性视神经萎缩症小鼠模型。OPA3基因的点突变（G93S）引起功能增强而出现显性遗传的视神经萎缩症。目前只有OPA3基因失活的小鼠，不能模拟由于点突变造成的视神经萎缩疾病表型。本研究拟利用课题组擅长的CRISPR基因编辑技术，模拟患者中发现的OPA3蛋白G93S突变，建立先天性视神经萎缩模型并进行表型鉴定，并开展基因治疗研究。通过优化sgRNA序列，获得能够区分单个碱基差异的序列，将突变的等位基因切除。同时将利用最新的腺苷单碱基编辑技术，定点将突变位点上的A高效转变成G，实现突变位点的精确修复，从而缓解轴突的萎缩及节细胞的进行性死亡，达到预防及治疗相关视神经萎缩的目的，为今后该类疾病的临床治疗提供新的方案和安全性。

视神经萎缩是由各种病因引起的视神经纤维退行性改变导致视觉功能障碍的疾病。目前已知的遗传因素以OPA家族基因的突变为主。OPA族蛋白包括OPA1-10，均为常染色体基因，参与线粒体相关蛋白的编码。OPA3 编码线粒体内膜相关蛋白。目前临床发现该基因的 277G-A(G93S)和 313C-G(Q105E)能够导致视神经萎缩并伴有轻微神经系统或者白内障等症状，为常染色体显性遗传疾病。. 为研究OPA3突变导致的视神经萎缩以及其基因治疗的方法，我们成功构建了模拟人视神经萎缩的OPA3（G93S）小鼠模型，并通过繁育得到了纯合子。经过组化实验我们确定，OPA3G93S纯合突变小鼠的视网膜节细胞数量明显减少，视神经细胞内的微管蛋白显著降低，与人视神经萎缩相符。.基因治疗是针对基因突变所致遗传病的有效治疗方法。为提高内源基因的编辑效率，课题组尝试通过共递送腺相关病毒受体的方式增强CRISPR/Cas9的内的递送效率从而间接提高编辑效率与相应的HDR水平，相关研究已发表在Science China Life Science。.由于单碱基编辑器极少产生双链DNA断裂，点突变效率显著高于HDR，其在基因治疗方面具有广阔的前景。课题组在单碱基编辑领域进行耕耘，首先开发了超高活性碱基编辑器-hyCBEs。相对于原来的CBE，hyCBEs在人类细胞系中活性均显著提高并且其工作窗口拓宽，向PAM区靠近。同时我们还将hyCBE与eA3A结合，所得到了hyeA3A-BE4max能够特异性靶向TC基序中的C，编辑窗口由spacer 序列的4-9位拓展为4-15位，活性最高提高了257倍，相关研究成果发表于国际学术期刊Natutre Cell Biology上。. 为打破目前碱基编辑器一次仅能编辑一种碱基底物的技术瓶颈，研究团队通过腺嘌呤脱氨酶-胞嘧啶脱氨酶-Cas9的融合，开发了新型碱基编辑器-A&C-BEmax，我们的结果显示，A&C-BEmax在同一等位基因中实现C到T和A到G同时转换的效率最高可达30%。通过ClinVar数据统计，A&C-BEmax可以通过一条PAM为NGG 的sgRNA联合纠正203种G到A与T到C临床上致病突变事件。相关研究发表于国际学术期刊Natutre Biotechnology。

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