基于ZFN/phiC31系统的新型基因打靶技术的建立（果蝇）

多细胞模式生物果蝇因清晰的遗传背景、高度保守的功能基因、强大的遗传调整性使其在现代生物医学研究中始终处于十分重要的位置。传统的果蝇基因打靶技术（gene targeting）通过定向改变遗传信息而广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型研制等。然而，基于ends-in/ends-out的传统基因打靶技术因耗时、耗力且需专业技术人员操作而使用受到限制。本项目拟改进传统打靶技术，通过建立基于果蝇胚胎细胞锌指酶筛选技术（ZFN）在靶基因位点附近产生DNA双链断口而诱导同源重组，快速融入phiC31重组酶介导的attP/B位点；随后通过phiC31重组技术（参考： Gao et al., 2008 PNAS；Choi et al., 2009 Science)定向引入基因敲除、特异性位点突变、GFP标签等。此项目将建立快速、高效、简捷的基因打靶新方法，为建立果蝇全基因组位点打靶提供理论与实践依据。

多细胞模式生物果蝇因其具有清晰的遗传背景和强大的遗传可调整性，一直是作为生物医学研究的重要模式生物之一。而定向突变体果蝇的获成为至关重要。目前，国际上关于果蝇基因打靶的方法，主要是整合了传统的ends-in/ends-out技术与phiC31重组酶介导的特异性DNA交换而引入突变位。这些方法需耗费大量人力和时间（一般要6-8个月），且需专业技术人员操作，限制了果蝇作为模式生物在其它生物领域的应用。近来，锌指酶技术（ZFN: zinc-finger nuclease）和Cas9（CRISPR-associated gene）已经开始应用于生物的基因组修饰与调整。其基本原理都是在特异性的基因靶位点进行切割产生一个DNA双链碎片（DSB），利用DSB可以进行同源重组或非同源末端连接方式引入突变。我们可以通过产生DSB快速融入外源DNA片段包括phiC31重组酶位点。随后通过phiC31介导的特异性DNA重组技术引入各种突变，方便功能基因组学的研究。主要研究内容：（1）靶位点的设计;（2）构建果蝇胚胎细胞双荧光素酶的检测报告系统。通过建立这一系统以方便进行基因内DSB产生的效率进行检测，其适用所有基因打靶效率的快速检测;（3）胚胎注射Cas9信使RNA和gRNA 测试Cas9的效率;（4）构建在果蝇生殖细胞中表达Cas9的品系并测试其效率;（5）结合Gal4/UAS系统，利用Cas9在特定的组织中突变目的基因;（6）通过同源重组，利用Cas9/phiC31敲除目的基因并敲入“att”位点以方便后面rescue实验。重要结果和关键数据（1）利用细菌双荧光报告系统，第一次检测到Cas9/gRNA具有对DNA具有切割活性，表明这一技术可用于基因打靶。（2）利用在生殖细胞中表达Cas9的品系，我们测试的每个基因也都有突变。（3）Cas9结合Gal4/UAS系统，我们实现了果蝇眼睛，翅膀，睾丸和卵巢等特定组织的基因突变。（4）通过同源重组，我们实现了敲除目的基因的同时敲入“att”位点，并利用该位点成功实现了原位rescue实验。科学意义：结合最新技术CRISPR与phiC31的重组技术，可快速的获得果蝇突变体，在敲除目的基因的同时，可以通过同源重组引入目的元件，使之前复杂耗时的基因打靶变的极为简单方便，一般两代1个月即可获得定向突变体。

内容获取失败，请点击重试