基于哺乳动物双杂交锌指核酶活性评估体系（M2HZT）的构建

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31171280
项目类别：
面上项目
资助金额：
50.0万
负责人：
王勇
依托单位：
中国人民解放军第三军医大学
学科分类：
C0607.基因组学
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
刘勤；刘昌峨；周晓杨；王露露；李亮；王庆华；
关键词：
活性 ZFN 遗传工程动物哺乳动物双杂交

项目摘要

ZFN（锌指核酶）是位点特异性核酸内切酶，是新近发展的动物基因组位点特异性修饰新技术。该技术不依赖于干细胞即可对动物基因组进行基因敲出或外源基因定点敲入，为创制遗传工程模式动物（尤其是除小鼠以外的大动物）提供了新手段。ZFN技术关键在于获得位点特异性高、结合力强的锌指结构域(ZF)。随着ZF设计与构建技术的发展、尤其是最近报道的无需繁琐筛选流程的ZF设计新技术CoDA的建立，ZF的设计与构建已不再是制约ZFN创制遗传工程动物的主要因素，而建立能更准确地评估ZF与靶位点在动物细胞、尤其是种系生殖细胞中实际结合活性的评价体系，已成为其关键。本项目拟以小鼠早期胚胎细胞为模型细胞，通过哺乳动物双杂交系统中在早期胚胎细胞中直接评估ZF与靶位点的实际结合活性，由此建立能更准确地预测ZFN在动物细胞、尤其在动物种系生殖细胞中实际活性的评价系统，为推动ZFN在遗传工程动物创制中应用提供有力技术工具。

结项摘要

以锌指核酶(ZFN)、TALEN、巨核酶(Meganuclease)以及最近发展的RNA引导的核酶Cas9等为代表的位点特异性核酶已成为重要的遗传修饰工具，将其高效地应用于哺乳动物、尤其是大动物的遗传修饰具有重要意义。小型猪是我国独特的模式动物资源，本项目以巴马小型猪为模式动物，建立了基于核酶的小型猪高效基因修饰技术体系。巨核酶I-SceI是经典的位点特异性核酶分子，其识别序列>18bp，在脊椎动物基因组中无酶切位点，已有效应用于鱼类、蛙类的基因修饰，但尚未成功地应用于哺乳动物。本项目研究首次发现，含哺乳动物核定位信号（NLS）的I-SceI融合分子NLS-I-SceI在哺乳动物胚胎细胞中不但具备I-SceI固有核酶活性和保护转基因片段免受内源性核酶降解的能力，还能将外源DNA片段从胞质转入胞核、并能介导外源转基因在胚胎细胞中高效表达，而无NLS的天然I-SceI分子则无此活性；基于NLS-I-SceI介导的基因转移，首次高效制备了转基因哺乳动物，创立了NLS-I-SceI分子介导的哺乳动物转基因新技术。sgRNA引导的核酶Cas9新近发展的革命性核酶技术，为了评估其对猪基因组的修饰活性，本项目将体外转录与纯化的Cas9/sgRNA混合物导入猪早期胚胎的细胞质，高效制备了首例胆固醇吸收与代谢重要功能基因Npc1l1的基因敲出小型猪。遗传分析表明：CRISPR/Cas9对靶位点的基因修饰效率高达100%，无可检测的脱靶突变；通过对首建猪不同组织的遗传分析发现，源自三个胚层的不同器官组织和卵巢中均含有相同的遗传突变，表明Cas9/sgRNA复合体在胚胎发育的极早期阶段即实现了对基因组的定向遗传修饰，并有效整合进入了生殖系统；通过基因敲出首建猪之间配种繁殖，在获得的F1代个体中获得了双等位基因敲出个体，进一步证明了Cas9/sgRNA介导基因修饰的可遗传性。TALEN是CRISPR/Cas9之外又一重要的遗传学技术。本项目通过TALEN mRNA导入猪早期胚胎，高效制备了B2m基因敲出猪，首建猪中基因敲出效率为85.7%（6/7)；通过首建猪的横交繁育，首次获得了B2m双等位基因敲出猪。依照项目预期计划，还构建了锌指核酶活性评估系统M2HZT，并筛选了针对猪Leptin基因的ZFN分子1对，但将其导入猪早期胚后未能获得基因修饰猪，提示ZFN活性在不同物种中可能存在差异。